一株產(chǎn)β-半乳糖苷酶菌株及其制備高純度低聚半乳糖的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種低聚半乳糖的制備方法，具體是利用重組亮白曲霉β -半乳糖苷酶基因的畢赤酵母菌株產(chǎn)β-半乳糖苷酶來催化合成低聚半乳糖的生產(chǎn)方法，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]低聚半乳糖(Galactooligosaccharides, GOS)具有低甜度、低熱量、低致願齒性、熱酸穩(wěn)定及食品安全性等特殊的性質(zhì)，是人體腸道中雙歧桿菌、嗜酸乳酸桿菌等有益菌極好的營養(yǎng)源和有效的增殖因子。它可以改善人體腸道的消化吸收功能，常作為一種新型的功能性食品添加劑，被稱為食療效果最好的“雙歧因子”。2008年9月，根據(jù)《中華人民共和國食品衛(wèi)生法》和《新資源食品管理辦法》的規(guī)定，批準(zhǔn)GOS為新資源食品。如今已被廣泛應(yīng)用于食品、保健品、乳制品、醫(yī)藥、飲料、飼料等各個行業(yè)，其生產(chǎn)應(yīng)用具有巨大的市場前景。
[0003]工業(yè)上一般采用米曲霉、脆壁克魯維酵母等生產(chǎn)低聚半乳糖。GOS初始生成的濃度多為30%左右，為了得到高純度的G0S，需要對GOS進(jìn)行分離純化。其方法包括色譜柱法、納濾膜法、酶法和微生物發(fā)酵法。其中微生物發(fā)酵法操作簡單，成本較低，其原理是利用微生物需代謝單糖或乳糖來得到生長的能量，從而將雜糖成分去除來達(dá)到純化的目的?，F(xiàn)有技術(shù)中，專利文獻(xiàn)報道了不同菌種產(chǎn)的β -半乳糖苷酶催化合成G0S，江波等人利用費式志賀菌產(chǎn)的β -半乳糖苷酶制備低聚半乳糖，產(chǎn)率達(dá)到44.5%;西班牙的Rodriguez-ColinasB等人利用來自乳酸克魯維酵母的β -半乳糖苷酶來催化合成低聚半乳糖，酵母細(xì)胞用乙醇處理后凍干，得到低聚半乳糖的最大產(chǎn)率為44%。對于GOS混合液中的單糖組分，有專利利用酵母等發(fā)酵消耗其中的葡萄糖，但是對半乳糖和乳糖沒有進(jìn)行很好的分離。同時，我國從20世紀(jì)90年代開始對GOS進(jìn)行工業(yè)化研宄，但高純度的GOS還沒有實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為克服現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種產(chǎn)β -半乳糖苷酶基因的畢赤酵母菌株。本發(fā)明同時提供了一種應(yīng)用上述菌株產(chǎn)的半乳糖苷酶催化高濃度乳糖水解和轉(zhuǎn)苷，合成GOS的生產(chǎn)方法。
[0005]本發(fā)明所述的產(chǎn)β -半乳糖苷酶的菌株為畢赤酵母(pichia pastoris)SMD1168H-pGAZaA-lac，該菌株是將自亮白曲霉菌體中克隆到的β-半乳糖苷酶基因通過基因工程手段轉(zhuǎn)化入畢赤酵母SMD1168H中，得到的高產(chǎn)半乳糖苷酶的畢赤酵母菌株。該菌株于2013年10月17日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研宄所)，菌種保藏編號為CGMCCN0.8349。
[0006]本發(fā)明利用上述菌株制備高純度低聚半乳糖的方法，其特征是，(一)利用畢赤酵母菌株SMD1168H-pGAZaA_lac制備β -半乳糖苷酶；(二)β -半乳糖苷酶催化乳糖合成低聚半乳糖；(三)通過馬克斯克魯維酵母純化低聚半乳糖混合液；(四)精制得到高純度的低聚半乳糖。
[0007]進(jìn)一步的，所述(一)利用畢赤酵母菌株SMD1168H-pGAZaA_lac制備β -半乳糖苷酶，具體包括以下步驟:
[0008](I)將畢赤酵母菌株SMD1168H-pGAZaA-lac接種于種子培養(yǎng)基中，于28_30°C條件下培養(yǎng)12-24h，得到種子液；
[0009](2)將步驟⑴的種子液按質(zhì)量比5-10%的接種量轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28-30°C，壓力0.1-0.2MPa，溶氧0.1% -20%條件下，培養(yǎng)48_96h，得發(fā)酵液；
[0010](3)將步驟⑵的發(fā)酵液離心，上清液即為β -半乳糖苷酶粗酶液；
[0011](4)將步驟(3)的粗酶液超濾濃縮、冷凍干燥得到β -半乳糖苷酶的粉末。
[0012]其中，所述步驟(I)中的種子培養(yǎng)基成分如下:酵母粉l-10g/L，蛋白胨l_20g/L，葡萄糖5-20g/L ;所述步驟(2)中的發(fā)酵培養(yǎng)基成分如下:KH2P04 5_20g/L，CaCl20.5-0.93g/L，MgSO4 l_15g/L，甘油 5_20g/L，葡萄糖 5_20g/L。
[0013]進(jìn)一步的，所述(二)半乳糖苷酶催化乳糖合成低聚半乳糖，具體包括以下步驟:
[0014](I)將凍干后的β -半乳糖苷酶粉末加入到濃度為200_450g/L的乳糖溶液中，得混合液；所述β -半乳糖苷酶的加入量為每克乳糖10-80U ；
[0015](2)將步驟(I)制得的混合液在30-45°C的條件下反應(yīng)20_48h，得低聚半乳糖粗液。
[0016]進(jìn)一步的，所述(三)通過馬克斯克魯維酵母純化低聚半乳糖混合液具體為:指將培養(yǎng)好的馬克斯克魯維酵母濕菌體以質(zhì)量比5-10%的接種量接入到滅酶活的低聚半乳糖粗液中，28-30°C培養(yǎng)12-24h，去除菌體后，上清液為高純度的低聚半乳糖溶液。
[0017]其中，所述馬克斯克魯維酵母菌體培養(yǎng)方法具體為:將馬克斯克魯維酵母接種于種子培養(yǎng)基中，28-30 °C培養(yǎng)12-20h后，然后以10-15 %的接種量轉(zhuǎn)接于乳糖培養(yǎng)基中，28-30°C培養(yǎng)48-96h，無菌條件下收集菌體。所述種子培養(yǎng)基采用酵母菌常用的培養(yǎng)基，如YB)液體培養(yǎng)基；所述乳糖培養(yǎng)基成分為，酵母粉l-10g/L，蛋白胨l-20g/L，乳糖5-20g/L。
[0018]進(jìn)一步的，所述(四)精制低聚半乳糖混合液后得到高純度的低聚半乳糖，具體為:將高純度低聚半乳糖溶液旋蒸濃縮，脫色，醇沉，烘干，粉碎后得到高純度低聚半乳糖粉末。
[0019]其中，所述的脫色是指用0.5-2%活性炭室溫下對低聚半乳糖溶液進(jìn)行脫色；所述的醇沉是指將脫色后的低聚半乳糖溶液，用3-5倍體積的工業(yè)酒精在高速攪拌下進(jìn)行沉淀，并對得到的沉淀用1-2倍工業(yè)酒精進(jìn)行二次脫水；所述的烘干是指將醇沉后的沉淀于45-65 °C下供干。
[0020]本發(fā)明的有益效果:
[0021]1、利用畢赤酵母菌株SMD1168H-pGAZaA-lac產(chǎn)β -半乳糖苷酶來催化合成GOS，收率達(dá)到30%以上。通過K.marxianus純化GOS混合液，工業(yè)酒精沉淀濃縮后GOS溶液，得到了純度為90%以上的GOS粉末，填補(bǔ)了我國高純度GOS的生產(chǎn)空白，促進(jìn)了 GOS在食品中的應(yīng)用，為社會帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益。
[0022]2、由于GOS本身具有高粘度，通常的噴霧干燥法需要加入輔料如麥芽糊精等才能制得固態(tài)的GOS。相比而言，本發(fā)明公開的醇沉法工藝簡單，GOS純度與收率較高，提供了一條優(yōu)化的生產(chǎn)工藝。
【具體實施方式】
[0023]為了更好的闡述本發(fā)明所提出的制備高純度低聚半乳糖的方法，下面通過實施案例對其作進(jìn)一步說明。
[0024]實施例1畢赤酵母菌株SMDl 168H-pGAZaA_lac的構(gòu)建與保藏
[0025]從亮白曲霉菌體中提取基因組，進(jìn)而獲得半乳糖苷酶基因，電泳進(jìn)行驗證；通過PCR擴(kuò)增目的基因片段，進(jìn)行雙酶切后與質(zhì)粒載體pGAPZaA相連，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，轉(zhuǎn)化成功后挑取單克隆，提取質(zhì)粒后進(jìn)行驗證。培養(yǎng)轉(zhuǎn)化成功的大腸桿菌，提取質(zhì)粒，并進(jìn)行線性化，然后將含有目的基因的線性化質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化到畢赤酵母SMDl 168Η中，通過在培養(yǎng)基中添加X-gal，利用顯色原理對有β -半乳糖苷酶活性的菌株進(jìn)行篩選，選取顏色深的菌進(jìn)行二次篩選；表達(dá)顏色深的重組畢赤酵母菌，對其發(fā)酵上清液測定半乳糖苷酶酶活，選取活性高的菌株，最終得到高產(chǎn)β -半乳糖苷酶的畢赤酵母菌株SMD1168H-pGAZaA-lac。
[0026]該菌株于2013年10月17日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCjfta:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研宄所)，菌種保藏編號為CGMCC N0.8349。
[0027]實施例2
[0028](I) 1L發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)畢赤酵母菌株SMD1168H-pGAZaA-lac制備β -半乳糖苷酶:將保存于_80°C的畢赤酵母菌株SMDl 168H-pGAZaA-lac甘油管接入種子培養(yǎng)基中，30°C條件下培養(yǎng)16h后，得到種子液；然后以質(zhì)量比10 %的接種量接入到1L發(fā)酵罐中，調(diào)節(jié)pH至7.0，30°C，壓力0.15Mpa，溶氧5-10%條件下培養(yǎng)72h，得到發(fā)酵液；發(fā)酵液10000r/min離心lOmin，收集上清即為β -半乳糖苷酶粗酶液。β -半乳糖苷酶粗酶液在4°C條件下通過1kDa的超濾膜濃縮10倍，將濃縮液冷凍干燥，得到75000U/g的β -半乳糖苷酶粉末。
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