一種添加紫球藻提高高山被孢霉發(fā)酵生產(chǎn)花生四烯酸產(chǎn)量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]
[0002]本發(fā)明涉及的是高山被孢霉發(fā)酵生產(chǎn)花生四烯酸的工藝方法，特別是一種添加紫球藻提高高山被孢霉發(fā)酵生產(chǎn)花生四烯酸產(chǎn)量的方法。
[0003]技術(shù)背景
[0004]花生四稀酸是一種ω-6多不飽和脂肪酸，英文縮寫為ARA(Arachidonic acid),又名AA，在體內(nèi)發(fā)揮多重作用。首先，它是體內(nèi)多種循環(huán)二十烷酸衍生物的前體，如前列腺素、前列腺環(huán)素、血栓烷素和白細(xì)胞三烯等；第二，花生四烯酸可促進(jìn)神經(jīng)及大腦發(fā)育，又因嬰幼兒體內(nèi)部分酶功能未完善，自身合成花生四烯酸能力較低，需補(bǔ)充外源花生四烯酸以促進(jìn)神經(jīng)及智力發(fā)育；第三，花生四烯酸作為結(jié)構(gòu)成分與磷脂相結(jié)合；另外，花生四烯酸還具有提高視覺敏銳度、增強(qiáng)血管彈性、降低血液黏稠度等多種生理功能。
[0005]花生四烯酸除動物組織提取外，工業(yè)上主要由兩類生物獲取，一是被孢霉類發(fā)酵生產(chǎn)，如高山被抱霉(Mortierella alpina)、深黃被抱霉(Mortierella isabellina)、長被孢霉(Mortierella elongata)等；二是通過海洋微藻培養(yǎng)所得，如紫球藻(Porphyridium)、缺刻緣綠藻(Porphyridium incisa)，但此方法目前應(yīng)用并不廣泛，僅處于實驗及試生產(chǎn)階段。
[0006]作為一種高效新型的營養(yǎng)強(qiáng)化劑，衛(wèi)生部在1994年正式批準(zhǔn)，可在嬰幼兒配方食品中添加花生四烯酸，并于1999年正式批準(zhǔn)花生四烯酸作為新型營養(yǎng)強(qiáng)化劑。目前，花生四烯酸已經(jīng)被世界衛(wèi)生組織等國際權(quán)威機(jī)構(gòu)推薦，作為營養(yǎng)補(bǔ)充添加到嬰兒配方奶粉中。當(dāng)前，國內(nèi)外花生四烯酸產(chǎn)業(yè)繼續(xù)呈現(xiàn)規(guī)?；瘮U(kuò)大的趨勢。
[0007]目前，國內(nèi)外提高花生四烯酸產(chǎn)量水平主要是通過對高山被孢霉進(jìn)行誘變育種，改善發(fā)酵工藝，利用基因工程手段改變關(guān)鍵酶基因等，或通過控制紫球藻培養(yǎng)條件來提高其不飽和脂肪酸及花生四烯酸的含量。例如“一種促進(jìn)花生四烯酸油脂高效積累的方法”(ZL201210056137.X)就是改善菌種培養(yǎng)條件，促進(jìn)提高花生四烯酸油脂含量的方法；“高山被孢霉突變株及其應(yīng)用”(201310578616.2)就是采用生物突變技術(shù)提高高山被孢霉花生四烯酸油脂含量的方法。它們都存在操作不便，性能不穩(wěn)定，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0008]然而卻未發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有公布將兩種高產(chǎn)PUFAS的紫球藻與高山被孢霉相結(jié)合來提高花生四烯酸產(chǎn)量，此方法以高山被孢霉發(fā)酵為主體，以紫球藻殘渣的加入為輔助手段，明顯提升了花生四烯酸的發(fā)酵產(chǎn)量，降低了生產(chǎn)成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]
[0010]本發(fā)明的目的在于提供一種添加紫球藻提高高山被孢霉發(fā)酵生產(chǎn)花生四烯酸產(chǎn)量的方法。
[0011]本發(fā)明包括以下步驟: 1)紫球藻培養(yǎng)
將紫球藻菌種接入裝有含淡水的培養(yǎng)皿中，在低鹽弱光條件下，10 - 15°C培養(yǎng)3 —6d后，將所得紫球藻及培養(yǎng)液經(jīng)80目篩子進(jìn)行篩濾并用蒸餾水清洗三次，用真空泵進(jìn)行抽濾，真空干燥24-48h，研磨成粉末狀備用；
2)高山被孢霉搖瓶種子培養(yǎng)
無菌條件下，取適量高山被孢霉孢子或菌絲涂布于PDA培養(yǎng)基中，置于26-30°C培養(yǎng)5-8d，刮取適量孢子至含有搖瓶種子培養(yǎng)基的三角瓶中，25-30°C，濕度30% — 60%條件下?lián)u床培養(yǎng)36h-48h，搖床轉(zhuǎn)速為180-250rmp/min ；
所述PDA培養(yǎng)基原料為葡萄糖15-25g/L，馬鈴薯100_200g/L，瓊脂粉10_20g/L，K2PO4
0.2-0.6 g/L，MgSO4 0.1-0.3 g/L，pH 7.0-7.5 ；
所述種子培養(yǎng)基為葡萄糖30-80g/L，酵母粉15-25g/L，pH 7.0-7.5 ；
3)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)
將高山被孢霉種子液按5%-10%的接種量接入含有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，25-30°C，濕度30% - 60%條件下?lián)u床培養(yǎng)8-14天，搖床轉(zhuǎn)速為180-250rmp/min ;在發(fā)酵O — 10天內(nèi)一次性添加紫球藻粉末10-60g/L，pH 7.0-7.5，發(fā)酵結(jié)束后收集菌體，經(jīng)處理采用油脂提取方法得花生四烯酸；
所述發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖30 - 80g/L，酵母粉15-25g/L，pH 7.0-7.5。
[0012]經(jīng)索式提取法和氣相檢測法測定，使用本發(fā)明所闡述的方法生產(chǎn)所得花生四烯酸的產(chǎn)量相對沒有添加紫球藻藻殘渣的花生四烯酸產(chǎn)量提高至少35%。
[0013]本發(fā)明的優(yōu)點是:
1.明顯提高了花生四烯酸產(chǎn)量；
2.操作簡單，較易實現(xiàn)；
3.減少環(huán)境污染。
【附圖說明】
[0014]
[0015]圖1為實施例1中在高山被孢霉發(fā)酵起始加入紫球藻殘渣對最后發(fā)酵結(jié)束時生物量(g/L)、細(xì)胞油脂百分含量(%)、花生四烯酸在總油中的含量(%)的影響柱狀圖。
[0016]圖2為實施例1中在高山被孢霉發(fā)酵起始加入紫球藻殘渣對最后發(fā)酵結(jié)束時細(xì)胞總油脂得率(g/L)、花生四烯酸得率(g/L)的影響柱狀圖。
[0017]圖3為實施例2中在高山被孢霉發(fā)酵5d加入紫球藻殘渣對最后發(fā)酵結(jié)束時生物量(g/L)、細(xì)胞油脂百分含量(%)、花生四烯酸在總油中的含量(%)的影響柱狀圖。
[0018]圖4為實施例2中在高山被孢霉發(fā)酵5d加入紫球藻殘渣對最后發(fā)酵結(jié)束時細(xì)胞油脂得率(g/L)、花生四烯酸得率(g/L)的影響柱狀圖。
[0019]圖5為實施例3中在高山被孢霉發(fā)酵1d加入紫球藻殘渣對最后發(fā)酵結(jié)束時生物量(g/L)、細(xì)胞油脂百分含量(%)、花生四烯酸在總油中的含量(%)的影響柱狀圖。
[0020]圖6為實施例3中在高山被孢霉發(fā)酵1d加入紫球藻殘渣對最后發(fā)酵結(jié)束時細(xì)胞油脂得率(g/L)、花生四烯酸得率(g/L)的影響柱狀圖。
[0021]圖7為在高山被孢霉發(fā)酵不同時間加入45 g/L紫球藻殘渣對最后發(fā)酵結(jié)束時細(xì)胞油脂得率(g/L)、花生四烯酸得率(g/L)的影響折線圖。
【具體實施方式】
[0022]
[0023]下面通過實施例對本發(fā)明做詳細(xì)說明。
[0024]實施例1
O紫球藻殘渣制備:將紫球藻菌種接入裝有含淡水的培養(yǎng)皿中，在低鹽弱光條件下，10 - 15°C培養(yǎng)3 — 6d后，將所得紫球藻及培養(yǎng)液經(jīng)80目篩子進(jìn)行篩濾并用蒸餾水清洗三次，用真空泵進(jìn)行抽濾，真空干燥24-48h，研磨成粉末狀備用。
[0025]2)搖瓶種子培養(yǎng):無菌條件下，取適量高山被孢霉孢子或菌絲涂布于PDA培養(yǎng)基中，置于26-30°C培養(yǎng)6-12d，然后刮取適量孢子至含有搖瓶種子培養(yǎng)基的三角瓶中，25-30°C，濕度30% - 60%條件下?lián)u床培養(yǎng)36_48h，搖床轉(zhuǎn)速為180_250rmp ；
所述PDA培養(yǎng)基原料為葡萄糖15-25g/L，馬鈴薯100_200g/L，瓊脂粉10_20g/L，K2PO4
0.2-0.6 g/L，MgSO4 0.1-0.3 g/L，pH 7.0-7.5 ；
所述種子培養(yǎng)基為葡萄糖30-80g/L，酵母粉15-25g/L，pH 7.0_7.5。
[0026]3)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)將種子液按5%_10%的接種量接入含有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，25-300C，濕度30% - 60%條件下?lián)u床培養(yǎng)8_14d，搖床轉(zhuǎn)速為180_250rmp ;在發(fā)酵起始對不同發(fā)酵瓶分別一次性添加紫球藻菌澄30 g/L、45 g/L和60 g/L，另有未添加紫球藻殘澄做對照組，pH 7.0-7.5，每組實驗平行發(fā)酵瓶為3個，發(fā)酵結(jié)束后得未分離花生四烯酸油脂發(fā)酵產(chǎn)物；所述發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖30 - 80g/L，酵母粉15-25g/L，pH 7.0-7.5。
[0027]至發(fā)酵結(jié)束時發(fā)酵液中細(xì)胞油脂百分含量及花生四烯酸產(chǎn)量分別通過索式提取法和氣相檢測法測定計算分別達(dá)到31.80%，3.95g/L ；33.60%，4.61 g/L ；33.40%，4.35g/L,對