一種提高高山被孢霉發(fā)酵生產花生四烯酸產量的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵領域，特別是一種提高高山被孢霉發(fā)酵生產花生四烯酸產 量的方法。 技術背景
[0002] 花生四稀酸即全順二十碳-5, 8, 11，14-四稀酸，英文縮寫為ARA(Arachidonic acid)，又名AA，是ω-6系列的長鏈多不飽和脂肪酸，在體內以代謝中間物發(fā)揮重要作用。 ARA作為前列腺素，白細胞三烯等多種循環(huán)二十烷酸衍生物的直接前體，有著多重生理調節(jié) 作用；同時，ARA可促進嬰幼兒的神經及大腦發(fā)育，對嬰幼兒的智力提升起著至關重要的作 用。除此之外，ARA還具有提高視覺敏銳度、增強血管彈性、降低血液黏稠度、抗炎癥、保護 皮膚等活性，已在食品、醫(yī)療、化妝品等領域得到廣泛應用。
[0003] ARA可由動物組織體取，但因含量較少，提取困難等，不適于工業(yè)化生產。除動 物組織提取外，在工業(yè)上主要由兩類生物獲取，一是被孢霉類發(fā)酵生產，如高山被孢霉 iMortierella alpina)、賴:貴被跑薦 i MortiereIla isabellina)發(fā)袍薦 i MortiereIla )等；通過海洋微藻培養(yǎng)所得，如紫球藻（/?/-/?紅rit/iw?)、缺刻緣綠藻 (/iOrjDAjTiiZiwffi iflcisa)，但此方法目前應用并不廣泛，僅處于實驗及試生產階段。目前，國 內外在工業(yè)上普遍使用高山被孢霉作為發(fā)酵菌株。
[0004] 作為一種高效新型的營養(yǎng)強化劑，衛(wèi)生部于1994年正式批準，可在嬰幼兒配方食 品中添加 ARA，并于1999年正式批準ARA作為新型營養(yǎng)強化劑。
[0005] 2012年衛(wèi)生部頒發(fā)《食品安全國家標準食品營養(yǎng)強化劑使用標準》（GB 14880- 2012)，ARA作為食品添加劑確定為來源于高山被孢霉
[0006] 目前，ARA已經被世界衛(wèi)生組織等國際權威機構推薦，作為營養(yǎng)補充添加到嬰兒配 方奶粉中，國內外花生四烯酸產業(yè)繼續(xù)呈規(guī)?；瘮U大趨勢。
[0007] 目前，國內外提高ARA產量水平主要是通過對高山被孢霉進行誘變育種、改善發(fā) 酵工藝、利用基因工程手段改變關鍵酶基因等，但因高山被孢霉發(fā)酵對氧濃度要求較高，有 文獻中指出利用氧載體，如正十六烷，Tween 20等通過改善發(fā)酵體系中氧傳遞速率提高產 量的方法，但此類氧載體價格昂貴，并不真正適用于工業(yè)生產，本發(fā)明中利用的油酸，價格 低廉，可在很大程度上節(jié)約成本，更適于工業(yè)上以發(fā)酵法制備ARA，且能夠明顯提升產量，更 具可行性。

【發(fā)明內容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于提供一種提高高山被孢霉發(fā)酵生產花生四烯酸產量的方法。
[0009] 本發(fā)明采用的技術方案如下： 一種提高高山被孢霉發(fā)酵生產花生四烯酸產量的方法，其特征在于：利用油酸作為氧 載體，在高山被孢霉發(fā)酵瓶接種種子液發(fā)酵一段時間后，向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入一定量的油 酸和適量的乳化劑，充分乳化，然后繼續(xù)發(fā)酵至發(fā)酵終點， 具體包括以下步驟： 1)搖瓶種子培養(yǎng) 無菌條件下，取適量高山被孢霉孢子或菌絲涂布于PDA培養(yǎng)基中，置于25-30°C培養(yǎng) 5-8天，刮取適量孢子至含有搖瓶種子培養(yǎng)基的三角瓶中，在25-30°C，濕度30%-60%條件下 搖床培養(yǎng)36-48h，搖床轉速為180-250rpm/min ; 所述PDA培養(yǎng)基的配方為：葡萄糖15-25g/L，馬鈴薯100-200g/L，瓊脂粉10-20g/L， K2PO4 0. 2-0. 6g/L, MgSO4 0. l-〇. 3 g/L, pH 6. 5-7. 0 ； 所述種子培養(yǎng)基的配方為：葡萄糖30-80g/L，酵母粉15-25g/L，pH 6. 5-7. 0。
[0010] 2)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng) 將種子液按5%-10%的接種量接入含有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，25-30°C，濕度30%-60% 條件下?lián)u床培養(yǎng)8-14天，搖床轉速為180-250rpm/min ;在發(fā)酵0-6天內一次性添加油酸 1%-3%，pH 6. 5-7. 0,發(fā)酵結束后得花生四烯酸； 所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：葡萄糖30-100g/L，酵母粉15-25g/L，pH 6. 5-7. 0。 toon] 所述的一種提高高山被孢霉發(fā)酵生產花生四烯酸產量的方法，其特征在于： 所述油酸是通過針筒式過濾器進行除菌，使用有機濾頭〇. 22 μ m。在高山被孢霉發(fā)酵的 0-6天內，將發(fā)酵液重量的1%_3%的油酸與發(fā)酵液通過乳化劑卵磷脂的乳化作用，轉化為乳 化液后繼續(xù)進行搖床培養(yǎng) 有益效果 經測定，使用本發(fā)明所闡述的方法生產所得花生四烯酸的產量比在相同條件下不添加 油酸的花生四烯酸產量提高了 30%-50%，花生四烯酸產量明顯提高，且成本較低，適于工業(yè) 生產。
【附圖說明】
[0012] 圖1為實施例1中在高山被孢霉發(fā)酵起始Oh油酸加入量對最后發(fā)酵結束時生物 量（g/L)、細胞油脂百分含量（%)、花生四烯酸在總油中的含量（%)的影響柱狀圖。
[0013] 圖2為實施例1中在高山被孢霉發(fā)酵起始Oh油酸加入量對最后發(fā)酵結束時細胞 油脂得率（g/L)、花生四烯酸得率（g/L)的影響柱狀圖。
[0014] 圖3為實施例2中在高山被孢霉發(fā)酵3天油酸加入量對最后發(fā)酵結束時生物量 (g/L)、細胞油脂百分含量（%)、花生四烯酸在總油中的含量（%)的影響柱狀圖。
[0015] 圖4為實施例2中在高山被孢霉發(fā)酵3天油酸加入量對最后發(fā)酵結束時細胞油脂 得率（g/L)、花生四烯酸得率（g/L)的影響柱狀圖。
[0016] 圖5為實施例3中在高山被孢霉發(fā)酵6天油酸加入量對最后發(fā)酵結束時生物量 (g/L)、細胞油脂百分含量（%)、花生四烯酸在總油中的含量（%)的影響柱狀圖。
[0017] 圖6為實施例3中在高山被孢霉發(fā)酵6天油酸加入量對最后發(fā)酵結束時細胞油脂 得率（g/L)、花生四烯酸得率（g/L)的影響柱狀圖。
[0018] 圖7為在高山被孢霉發(fā)酵不同時間油酸加入量為2%時對最后發(fā)酵結束時細胞油 脂得率（g/L)、花生四烯酸得率（g/L)的影響折線圖。
【具體實施方式】
[0019] 下面通過實施例對本發(fā)明做詳細說明。
[0020] 實施例1 1)油酸制備：油酸是通過針筒式過濾器進行除菌，使用有機濾頭〇. 22 μ m。
[0021] 2)搖瓶種子培養(yǎng)：無菌條件下，取適量高山被孢霉孢子或菌絲涂布于PDA培養(yǎng)基 中，置于25-30°C培養(yǎng)7天（5-8天是根據(jù)實際成長狀態(tài)來決定，每次不一定一致)，然后刮取 適量孢子至含有搖瓶種子培養(yǎng)基的三角瓶中，27°C，濕度45%條件下?lián)u床培養(yǎng)30h，搖床轉 速為200rpm，得到種子；其中種子培養(yǎng)基為葡萄糖50g/L，酵母粉20g/L，pH 6. 8 ;PDA培養(yǎng) 基的配方為：葡萄糖 20g/L，馬鈴薯 150g/L，瓊脂粉 15g/L，K2PO4 0. 4g/L，MgSO4 0. 2g/L，pH 6· 5-7· 0〇
[0022] 3)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：將種子液按10%的接種量接入含有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中， 并且分別將1%、2%、3%的油酸與發(fā)酵液通過表面活性劑卵磷脂的乳化作用，其中卵磷脂加 入量為1%，轉化為乳化液后，在25-30°C，濕度45%條件下?lián)u床培養(yǎng)8-14天，搖床轉速為 180-250rpm，進行搖床培養(yǎng)。
[0023] 另有未添加油酸，僅添加等量卵磷脂的對照組，每組實驗平行發(fā)酵瓶為3個，發(fā)酵 結束后得未分離花生四烯酸油脂；所述發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖30-100g/L，酵母粉15-25g/ L, pH 6. 5-7. 0〇
[0024] 至發(fā)酵結束時對添加1%、2%、3%的油酸及對照組(只添加乳化劑，未添加油酸)的發(fā) 酵液中生物量、細胞油脂百分量、油脂得率、花生四烯酸在油脂中百分含量及花生四烯酸得 率分別進行測定計算。計算結果見表1。
[0025] 表 1
【主權項】
1. 一種提高高山被孢霉發(fā)酵生產花生四烯酸產量的方法，其特征在于：利用油酸作為 氧載體，在高山被孢霉發(fā)酵瓶接種種子液發(fā)酵開始或一段時間后，向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入一 定量的油酸和適量的乳化劑，充分乳化，然后繼續(xù)發(fā)酵至發(fā)酵終點。
2. 根據(jù)權利要求1所述的一種提高高山被孢霉發(fā)酵生產花生四烯酸產量的方法，其特 征在于：所述油酸的加入量為發(fā)酵培養(yǎng)液總量的1% -3%。
3. 根據(jù)權利要求2所述的一種提高高山被孢霉發(fā)酵生產花生四烯酸產量的方法，其 特征在于：所述油酸的加入量為發(fā)酵培養(yǎng)液總量的2%。
4. 根據(jù)權利要求1所述的一種提高高山被孢霉發(fā)酵生產花生四烯酸產量的方法，其特 征在于：所述乳化劑為卵磷脂，卵磷脂加入量為1%。
5. 根據(jù)權利要求1所述的一種提高高山被孢霉發(fā)酵生產花生四烯酸產量的方法，所 述的向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入一定量的油酸和適量的乳化劑的時間為接種后發(fā)酵的第0-6天。
6. 根據(jù)權利要求5中所述的一種提高高山被孢霉發(fā)酵生產花生四烯酸產量的方法，所 述的向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入一定量的油酸和適量的乳化劑的時間為接種后發(fā)酵的第3天。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種提高高山被孢霉發(fā)酵生產花生四烯酸產量的方法，它是一種往高山被孢霉發(fā)酵培養(yǎng)基中添加油酸提高花生四烯酸產量的方法。對高山被孢霉發(fā)酵瓶接種后，在不同發(fā)酵時間點加入不同比列的油酸并通過乳化劑進行乳化作用后檢測最終發(fā)酵液中花生四烯酸產量，經比較發(fā)現(xiàn)添加油酸的花生四烯酸產量明顯優(yōu)于未添加的發(fā)酵產量。本發(fā)明具有花生四烯酸產量明顯提升、降低發(fā)酵成本、無污染等優(yōu)勢，適用于工業(yè)化生產。
【IPC分類】C12P7-64, C12R1-645
【公開號】CN104805140
【申請?zhí)枴緾N201510164029
【發(fā)明人】凌瑞, 孫立潔, 陳祥松, 袁麗霞, 姚建銘, 王紀, 吳金勇, 劉偉偉
【申請人】中國科學院等離子體物理研究所
【公開日】2015年7月29日
【申請日】2015年4月8日