一種豬胸主動脈中提取水不溶性膠原蛋白的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物制品領(lǐng)域，尤其是涉及一種以豬胸主動脈為原料，通過脫脂、除 雜、酶解、鹽析、透析等工藝步驟制備水不溶性膠原蛋白的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 膠原蛋白主要存在于動物結(jié)締組織中，是哺乳動物體內(nèi)含量最多、分布最廣的功 能性蛋白，對機體和臟器起著支撐、保護、結(jié)合和界隔等作用，在關(guān)節(jié)潤滑、組織形成及成 熟、凝血作用、傷口愈合、細胞間信號傳遞、運載生物因子和衰老等方面都起著舉足輕重的 作用。
[0003] 膠原蛋白在工業(yè)中廣泛應(yīng)用于化妝品、食品、保健品中，此外，由于膠原蛋白的低 免疫源性、止血作用、可促進細胞增殖和細胞生長、可生物降解且降解產(chǎn)物無毒副作用等諸 多優(yōu)點，被越來越多的應(yīng)用到組織工程中，例如人工皮膚、傷口敷料、人工骨骼、人造腱以及 人造血管等多種生物材料。
[0004] 目前獲得膠原蛋白的主要途徑是從畜禽類動物組織以及海洋生物中提取分離，且 主要產(chǎn)物為水溶性膠原蛋白。該類膠原不能在水體系中成型，并且在體內(nèi)環(huán)境中，極易被降 解。盡管可通過化學交聯(lián)來改性膠原材料，卻降低了膠原材料使用的安全性。此外，常規(guī)提 取對原料的堿處理或高溫處理，會對原料中膠原蛋白成分造成破壞，并且水溶性這一特性 使得純化過程繁瑣。
[0005] 我國是養(yǎng)豬大戶，除了供應(yīng)日常食用需求，目前豬皮已被回收提取膠原，小腸用來 提取具有抗凝血活性的肝素鈉以外，其余成分均被遺棄，沒有得到更好的利用，浪費資源又 污染環(huán)境。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本發(fā)明提供一種豬胸主動脈中提取水不溶性膠原 蛋白的方法。本發(fā)明方法充分利用了工業(yè)廢料豬血管，實現(xiàn)了變廢為寶，且工藝步驟簡單安 全并易于操作、產(chǎn)品純度高。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：取檢疫合格的豬，無菌開腔取胸主動脈，冷凍干燥粉碎。 經(jīng)丙酮低溫脫脂、鹽酸胍或尿素低溫去除蛋白聚糖等雜質(zhì)后，再經(jīng)胃蛋白酶酶解后，繼續(xù)用 鹽析法獲得水不溶性膠原蛋白粗品沉淀。沉淀用醋酸溶液重新溶解后，逐步對醋酸溶液和 蒸餾水透析，所得沉淀冷凍干燥后既得水不溶性膠原蛋白產(chǎn)品。
[0008] 本發(fā)明有益的技術(shù)效果在于：
[0009] 1、本發(fā)明方法中豬胸主動脈預處理后經(jīng)低溫有機熔劑脫脂、表面活性劑去除蛋白 聚糖的步驟，達到了初步脫脂去除雜質(zhì)的效果。
[0010] 2、本發(fā)明方法所得膠原蛋白不溶于水，與現(xiàn)有技術(shù)生產(chǎn)出的產(chǎn)品相比，純化過程 簡單，且產(chǎn)品純度高。
[0011] 3、本發(fā)明方法整個生產(chǎn)工藝中的酸性條件，避免了堿性環(huán)境對膠原蛋白的變性作 用，不改變原料中膠原蛋白的性質(zhì)，保持了其原有的生物活性，因此本發(fā)明制得的膠原蛋白 具有很好的生物活性，安全可靠，無毒副作用。且與現(xiàn)有技術(shù)生產(chǎn)出的水溶性膠原蛋白產(chǎn)品 相比較，降解速率大幅度降低，延長了作用時間，凝血速度更快，可滿足機體自修復要求。
[0012] 4、本發(fā)明方法以豬胸主動脈為原料，成本低，所需設(shè)備簡單，提取剩余殘渣還可作 為生產(chǎn)飼料繼續(xù)使用，充分利用了資源，又降低了環(huán)境污染，生產(chǎn)過程中用有機試劑低溫脫 月旨，有效去除脂類成分，蛋白變性劑去除蛋白聚糖后，酶降解法提取膠原蛋白，再用鹽析法 沉淀膠原蛋白，最后經(jīng)逐步透析冷凍干燥得到水不溶性膠原蛋白。
[0013] 6、本發(fā)明方法包括預處理、脫脂、除雜、酶解、鹽析、重溶、透析、冷凍干燥的工藝步 驟，按照工藝順序進行，各步驟相輔相承，共同配合完成膠原蛋白的提取，缺一不可。
【具體實施方式】
[0014] 下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明進行具體描述。
[0015] 實施例1
[0016] -種豬胸主動脈中提取水不溶性膠原蛋白的方法，包括如下步驟：
[0017] (1)預處理：采用檢疫合格的豬，無菌開腔，取胸主動脈，剔除表面結(jié)締組織后，用 無菌水漂洗干凈后，冷凍干燥，粉碎至100目；
[0018] (2)脫脂：將步驟（1)粉碎的胸主動脈，置于丙酮試劑中，于-20°c條件下攪拌12h 后，5000r/min的轉(zhuǎn)速下，離心30min，去除乳白色上清液，更換新丙酮試劑重復上述脫脂操 作，直至上清液呈清亮透明狀，去除上清液，將下層產(chǎn)品置于真空干燥箱風干；
[0019] (3)除雜：在步驟（2)所得下層產(chǎn)品中，加入產(chǎn)品重量10倍體積的4M鹽酸胍溶液， 于4°C條件下攪拌72h后，8000r/min的轉(zhuǎn)速下，離心30min，去除上清液后，下層產(chǎn)品經(jīng)蒸 餾水漂洗2次至上清液為中性，8000r/min的轉(zhuǎn)速下，離心30min，去除上清液，保留下層產(chǎn) 品；
[0020] (4)酶解：在步驟⑶所得下層產(chǎn)品中，加入液料比為50mL/g的0. 5M醋酸溶液， 再加入產(chǎn)品重量0. 05倍的胃蛋白酶，于37°C條件下反應(yīng)30h后，8000r/min的轉(zhuǎn)速下，離心 30min，去除下層沉淀，保留上清液；
[0021] (5)鹽析：常溫攪拌狀態(tài)下在步驟⑷制得的上清液中，加入粉末狀NaCl至飽和， 8000r/min的轉(zhuǎn)速下，離心20min，去除上清液，保留沉淀物；
[0022] (6)重溶：將步驟（5)離心所得的沉淀物用0. 5M醋酸溶液溶解，8000r/min的轉(zhuǎn)速 下，離心20min，去除不溶物，保留上清液；
[0023] (7)透析：將步驟（6)制得的上清液，在0. 5M醋酸溶液中對截留分子量為HOOODa 的透析袋透析3d后，再在0.1 M醋酸溶液中透析3d，最后在蒸餾水中透析至置換液為中性；
[0024] (8)冷凍干燥：將步驟（7)所得的透析產(chǎn)物，在8000r/min的轉(zhuǎn)速下，離心30min， 去除上清液，收集沉淀物并冷凍干燥，即得水不溶性膠原蛋白。
[0025] 實施例2
[0026] 一種豬胸主動脈中提取水不溶性膠原蛋白的方法，包括如下步驟：
[0027] (1)預處理：采用檢疫合格的豬，無菌開腔，取胸主動脈，剔除表面結(jié)締組織后，用 無菌水漂洗干凈后，冷凍干燥，粉碎至70目；
[0028] (2)脫脂：將步驟（1)粉碎的胸主動脈，置于丙酮試劑中，于_20°C條件下攪拌12h 后，5000r/min的轉(zhuǎn)速下，離心30min，去除乳白色上清液，更換新丙酮試劑重復上述脫脂操 作，直至上清液呈清亮透明狀，去除上清液，將下層產(chǎn)品置于真空干燥箱風干；
[0029] (3)除雜：在步驟（2)所得下層產(chǎn)品中，加入產(chǎn)品重量12倍體積的4M鹽酸胍溶液， 于4°C條件下攪拌72h后，8000r/min的轉(zhuǎn)速下，離心30min，去除上清液后，下層產(chǎn)品經(jīng)蒸 餾水漂洗3次至上清液為中性，8000r/min的轉(zhuǎn)速下，離心30min，去除上清液，保留下層產(chǎn) 品；
[0030] (4)酶解：在步驟（3)所得下層產(chǎn)品中，加入液料比為80mL/g的0. 5M醋酸溶液， 再加入產(chǎn)品重量0. 05倍的胃蛋白酶，于37°C條件下反應(yīng)24h后，8000r/min的轉(zhuǎn)速下，離心 30min，去除下層沉淀，保留上清液；
[0031] (5)鹽析：常溫攪拌狀態(tài)下在步驟⑷制得的上清液中，加入粉末狀NaCl至飽和， 8000r/min的轉(zhuǎn)速下，離