利用光合細(xì)菌微氧發(fā)酵快速生產(chǎn)類胡蘿卜素的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于發(fā)酵領(lǐng)域，具體涉及利用光合細(xì)菌微氧發(fā)酵快速生產(chǎn)類胡蘿卜素的方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 類胡蘿卜素是一類脂溶性色素，大多難溶于水，可溶于有機(jī)溶劑，是全球生態(tài)系統(tǒng) 中的一大類色素，是自然界中分布非常廣泛和十分重要的色素之一。類胡蘿卜素能增加機(jī) 體免疫功能和細(xì)胞之間的縫間聯(lián)接交流，具有抗氧化功能、抗癌功能、能量傳遞等重要功 能。因其抗氧化性，成為國際藥物、膳食補(bǔ)充劑、功能食品等領(lǐng)域廣泛關(guān)注的新型抗氧化活 性物質(zhì)，被譽(yù)為二十一世紀(jì)抗氧化劑時(shí)代的"新貴"。
[0003] 化學(xué)合成的類胡蘿卜素不易被人體吸收，并且有一定的毒副作用，沒有被大規(guī)模 采用。相反，天然類胡蘿卜素卻受到越來越多的研宄與重視。目前，天然類胡蘿卜素的來源 主要是從天然植物中提取和微生物發(fā)酵獲取。從植物中提取類胡蘿卜素的產(chǎn)量較低，提取 成本較高，浪費(fèi)較大，并且受季節(jié)性影響較大。利用光合細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)天然類胡蘿卜素是目 前獲取類胡蘿卜素的重要來源之一。光合細(xì)菌廣泛分布在江河、沼澤、海洋以及污泥等，生 命力非常強(qiáng)、容易培養(yǎng)、生長繁殖速度快、本身無毒，富含蛋白質(zhì)、維他命，成為現(xiàn)代生物技 術(shù)研宄的熱點(diǎn)。光合細(xì)菌富含天然類胡蘿卜素，容易分離提取，色彩鮮艷。目前，光合細(xì)菌 色素廣泛應(yīng)用于油脂類、水果蔬菜類、豆制品和飲料等的著色。類胡蘿卜素是光合細(xì)菌最 重要的光合色素之一，具有吸收光能的作用，其主要作用是抗光氧化破壞，驅(qū)散多余的輻射 能，保持捕光系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和豐度。雖然光合細(xì)菌富含天然類胡蘿卜素，但是目前光合細(xì)菌還 未真正用于工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)天然類胡蘿卜素。其中一個(gè)重要原因在于目前采用的光合細(xì)菌 發(fā)酵生產(chǎn)天然類胡蘿卜素方法是光照發(fā)酵法，該法非常耗時(shí)，發(fā)酵周期1-2周，甚至更長， 嚴(yán)重影響效率。因此，建立一種利用光合細(xì)菌微氧發(fā)酵快速生產(chǎn)類胡蘿卜素的方法是非常 必要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供利用光合細(xì)菌微氧發(fā)酵快速生產(chǎn)類胡蘿卜素的 方法，方法簡單，能夠使光合細(xì)菌Rhodobacter sphaeroides類胡蘿卜素合成途徑結(jié)構(gòu)基因 獲得高效表達(dá)，菌體量大，類胡蘿卜素產(chǎn)量高，具有良好的清除DPPH自由基的能力。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明的提供如下技術(shù)方案：
[0006] 利用光合細(xì)菌微氧發(fā)酵快速生產(chǎn)類胡蘿卜素的方法，包括如下步驟：將活化的光 合細(xì)菌（Rhodobacter sphaeroides)單菌落接種到MMS培養(yǎng)基中，好氧過夜培養(yǎng)獲得種子； 然后按接種量為8%將好氧過夜培養(yǎng)的種子分別接種到含有MMS培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，接種 后培養(yǎng)液體積相當(dāng)于培養(yǎng)瓶體積的40%，然后在轉(zhuǎn)速為200~250rpm、溫度為30~32°C、 黑暗條件下好氧發(fā)酵至0D600為0. 6-0. 8 ;合并發(fā)酵液，使發(fā)酵液體積相當(dāng)于培養(yǎng)瓶體積的 80%，再在轉(zhuǎn)速為140~150rpm、溫度為30-32°C、黑暗條件下微氧發(fā)酵36小時(shí)。
[0007] 優(yōu)選的，所述好氧發(fā)酵的條件是在溫度為30°C、轉(zhuǎn)速為250rpm、黑暗條件下培養(yǎng)。
[0008] 優(yōu)選的，所述微氧發(fā)酵的條件是在溫度為30°C、轉(zhuǎn)速為150rpm、黑暗條件下培養(yǎng)。
[0009] 優(yōu)選的，所述活化的光合細(xì)菌由以下方法制得：先將光合細(xì)菌劃線培養(yǎng)于MMS固 體培養(yǎng)基上至長出紅色單菌落，然后挑取紅色單菌落接種于MMS體培養(yǎng)基中至光合細(xì)菌長 至粉紅色。
[0010] 優(yōu)選的，所述MMS培養(yǎng)基的組分及濃度如下：DL-蘋果酸3g/L ;MgS04X 7H20 0. 2g/ L ; (NH4)2SO4 I. 2g/L ;CaCl2X2H20 0· 07g/L ;微量元素溶液 I. 5ml/L，NaOH 調(diào)節(jié) pH 至 6· 9,高 壓蒸汽滅菌后按20ml/L和8ml/L分別加入50Χ磷酸溶液和維生素緩沖液；
[0011] 所述微量元素溶液各組分及濃度如下：Fe(III)-Citrat 500mg/L，MnCl2X4H20 20mg/L，ZnCl2 5mg/L，LiCl 5mg/L，KI 2. 5mg/L，KBr 2. 5mg/L，CuSO4 0·15mg/L ;
[0012] 所述50 X磷酸溶液各組分及濃度如下！K2HPO4 45g/L，KH2PO4 30g/L ;
[0013] 所述維生素緩沖液各組分及濃度如下：煙酸200mg/L，維生素 BI 400mg/L，煙酰胺 200mg/L，生物素 8mg/L。
[0014] 更優(yōu)選的，誘導(dǎo)類胡蘿卜素合成后還包括類胡蘿卜素的提取步驟，具體為：收集發(fā) 酵液，離心收集菌體，然后向菌體中加入萃取劑重懸菌體，重懸后進(jìn)行超聲波破碎，再離心 收集上清，接著向上清液中按照料液比為1:40補(bǔ)足萃取劑浸提，離心收集上清，沉淀再按 料液比為1:40加入萃取劑浸提，再次離心收集上清液，合并上清液，減壓蒸餾抽干，殘余物 用乙醚溶解，然后加入等體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的KOH甲醇液皂化，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的 NaCl溶液萃取，收集醚層并用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的NaCl溶液洗滌去除甲醇，最后抽干乙醚，得 類胡蘿卜素；所述萃取劑為丙酮和甲醇體積比為7:2的溶液。
[0015] 本發(fā)明的有益效果在于：利用微氧發(fā)酵法，建立了一種利用光合細(xì)菌 Rb. sphaeroides快速發(fā)酵生產(chǎn)類胡蘿卜素的方法，利用微氧黑暗條件快速發(fā)酵生產(chǎn)類胡蘿 卜素，經(jīng)發(fā)酵后離心收集菌體，用超聲波破碎細(xì)胞，經(jīng)丙酮甲醇（7:2)混合液分級浸提后減 壓蒸餾抽干，用適量乙醚溶解后加入等體積的10%的KOH甲醇溶液皂化處理除去細(xì)菌葉綠 素，再用5 %的NaCl溶液分層處理分離甲醇和細(xì)菌葉綠素，最后減壓蒸餾抽干得到類胡蘿 卜素粉末，并進(jìn)行清除DPPH自由基試驗(yàn)，該發(fā)明可用于利用微生物快速發(fā)酵生產(chǎn)類胡蘿卜 素，且發(fā)酵時(shí)間短，僅用36h，較傳統(tǒng)光照發(fā)酵法大大縮短了發(fā)酵周期，對促進(jìn)光合細(xì)菌工業(yè) 化規(guī)模生產(chǎn)類胡蘿卜素具有重要的意義。
【附圖說明】
[0016] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖：
[0017] 圖1為本發(fā)明的光合細(xì)菌微氧發(fā)酵大量合成類胡蘿卜素后的顏色。
[0018] 圖2為類胡蘿卜素皂化前后的紫外可見掃描分析。
[0019] 圖3為類胡蘿卜素的TLC分析。
[0020] 圖4為類胡蘿卜素的穩(wěn)定性分析。
[0021] 圖5為類胡蘿卜素清除DPPH自由基分析。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 下面將結(jié)合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。實(shí)施例中未注明具體 條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。
[0023] 本發(fā)明所使用的實(shí)驗(yàn)材料如下：
[0024] (I)MMS 培養(yǎng)基（Malate Minimal Salt-Medium) :DL-Malic_Acid 3g/L ; MgSO4X 7H20 0· 2g/L ; (NH4)2SO4 I. 2g/L ;CaCl2X 2H20 0· 07g/L ;微量元素溶液（Trace Metal Solution) I. 5ml/L，NaOH調(diào)節(jié)pH至6. 9,高壓蒸汽滅菌后分別按20ml/L和8ml/ L加入50X磷酸溶液和維生素緩沖液（參考文獻(xiàn)見：Drew，G. (1983)Mikrobiologisches Praktikum. Heidelberg:Springge-Verlag)〇
[0025] (2)微量元素溶液：Fe (III)-Citrat 500mg/L，MnCl2 X 4H20 20mg/L，ZnCl2 5mg/L， LiC15mg/L，KI 2. 5mg/L，KBr 2. 5mg/L，CuSO4 0· 15mg/L，滅菌后 4°C保存。
[0026] (3)5〇 X 磷酸溶液！K2HPO4 45g/L，KH2PO43〇g/L。
[0027] (4)維生素緩沖液：煙酸200mg/L，維生素 BI 400mg/L，煙酰胺200mg/L，生物素 8mg，過濾滅菌，4°C放置。
[0028] (5)丙酮甲醇（7:2)混合液：準(zhǔn)確量取丙酮350mL丙酮倒入500mL的棕色瓶中，然 后加入IOOmL的甲醇，混勻。
[0029] (6) 10% KOH甲醇溶液：準(zhǔn)確稱取100g Κ0Η，溶于適量的甲醇中，攪拌溶解，補(bǔ)充甲 醇至 10OOmT,η
[0030] (7) TLC展開劑：正己烷：甲醇：丙酮按體積比為70:29:1混合。
[0031] (8)0.1 mM DPPH :精密稱取3. 9mg DPPH，用移液管量取IOmL甲醇溶解到比色管，再 用移液管轉(zhuǎn)移到IOOmL容量瓶中，甲醇定容至100mL，即配成0.1 mM的DPPH。
[0032] (9)5% NaCl :準(zhǔn)確稱取50g NaCl，溶于適量的水中，充分溶解，補(bǔ)充水至1000mL。
[0033] 實(shí)施例1、光合細(xì)菌的活化
[0034] 將_80°C保存的光合細(xì)菌（Rb. sphaeroides)劃線培養(yǎng)于MMS固體培養(yǎng)基上，在 30°C培養(yǎng)大約4d長出紅色單菌落；然后，挑取紅色單菌落接種于裝有10~20mL MMS液體 培養(yǎng)基的50mL錐形瓶中，再在30°C、200rpm條件下培養(yǎng)18h，至