檢測kras基因突變的試劑盒及其檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及檢測kras基因突變的試劑盒，該涉及利用該 試劑盒在非疾病診斷中檢測kras基因突變的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] Kras基因?yàn)镽as基因家族中的一員，編碼的Ras蛋白P21具有GTP水解酶活性，是 人類表皮生長因子受體（Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)依賴的下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo) 通路Ras-Raf-MPK途徑中的重要成員。Kras基因突變導(dǎo)致P21蛋白與GTP牢固結(jié)合，持 續(xù)激活傳導(dǎo)通路的級聯(lián)反應(yīng)，刺激細(xì)胞生長、增殖、分化引起癌變。據(jù)報(bào)道，Kras基因的突 變率約占結(jié)直腸癌總體患者的30% -60%。在這些突變中，80 % -90 %的突變熱點(diǎn)主要位 于KRAS基因的2號外顯子的密碼子12位和13位上，包括7中突變類型：G13D、G12D、G12A、 G12V、G12S、G12R、G12C〇
[0003] 作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路Ras-Raf-MAPK途徑中的上游信號分子，EGFR在60-80 %的結(jié)直 腸癌中過度表達(dá)。以EGFR為靶點(diǎn)的藥物，可阻斷EGFR信號傳導(dǎo)，從而抑制腫瘤新生血管形 成、腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移。但該類藥物只能對Kras基因野生型的結(jié)直腸癌患者有效，使 病人的預(yù)后得到改善。由于突變型的P21蛋白無需接收EGFR信號，能夠自動(dòng)活化該通路并 啟動(dòng)下游信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)。因此，Kras基因野生型的患者能從抗EGFR的藥物中獲益，突變型患 者則不行。Kras基因突變狀態(tài)與預(yù)測腫瘤患者應(yīng)用靶向藥物的有效性以及更好的進(jìn)行個(gè)體 化治療中起著重要作用。美國國家癌癥綜合治療聯(lián)盟（National Comprehensive Cancer Network，NCCN)《結(jié)直腸癌臨床實(shí)踐指南》明確指出：（1)所有轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者都應(yīng)檢 測Kras基因狀態(tài)；（2)只有Kras野生型患者才建議接受EGFR抑制劑（如愛必妥和帕尼單 抗）治療。
[0004] 因此，檢測組織或血漿中Kras基因突變對于指導(dǎo)腸癌等癌癥患者臨床用藥，具有 重要的參考價(jià)值。
[0005] 目前檢測基因突變的方法主要有以下幾種：
[0006] (1)直接測序法，其原理是：首先針對突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)探針（每個(gè)基因設(shè)計(jì)一對探 針，探針?biāo)鶎?yīng)的產(chǎn)物盡可能的包含突變位點(diǎn)所在的位置），然后通過簡單PCR擴(kuò)增獲得目 的基因產(chǎn)物，最后對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序并且對測序結(jié)果進(jìn)行初步分析。初步分析完成后，對 一些可能的突變樣品的PCR產(chǎn)物，需要對目的條帶進(jìn)行切膠回收；回收后的PCR產(chǎn)物連接 克隆載體；挑選陽性克隆測序并對測序結(jié)果進(jìn)行分析。此過程比較繁瑣、耗時(shí)長，而且由于 測序方法本身的限制導(dǎo)致其靈敏度不高，只能對含量大于20%的基因突變進(jìn)行檢測。因此， 此法不適合在臨床中的應(yīng)用與大量的臨床樣本分析。
[0007] ⑵變性高效液相色譜法（denaturing high-performance liquid chromatograph，DHPLC)。該方法的原理是基于發(fā)生錯(cuò)配的雜合雙鏈DNA與完全匹配的純合 雙鏈DNA解鏈特征的差異將他們分離開。由于雜合雙鏈在突變位點(diǎn)處出現(xiàn)錯(cuò)配，更易于形 成"Y"形結(jié)構(gòu)，與固定相的結(jié)合能力降低，因此雜合DNA鏈要比純合DNA鏈優(yōu)先洗脫出來， 通過洗脫峰的不同判斷有無突變存在。DHPLC可檢測出含有單個(gè)檢測的突變、插入或者缺失 的異源雙鏈片段。該法對已知和未知的突變位點(diǎn)均可以檢測，敏感性在5%左右，但檢測過 程中需要打開反應(yīng)管，容易造成污染，而且陽性結(jié)果不能確認(rèn)其具體未知，最終還需測序確 認(rèn)。
[0008] (3)高分辨率溶解曲線（high resolution melting，HRM)。高分辨率溶解曲線是 基于核酸的物理性質(zhì)，通過飽和染料結(jié)合于PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，監(jiān)控產(chǎn)物熔解曲線的變化分析 基因突變。檢測敏感性在5%左右，對于陽性結(jié)果并不能確定其具體位置，最終還需要通過 測序加以確認(rèn)。
[0009] (4)探針擴(kuò)增阻滯突變法（amplification refractory mutation system，ARMS)。 利用PCR探針的3'端末位堿基必須與其模板DNA互補(bǔ)才能有效擴(kuò)增的原理，設(shè)計(jì)針對突變 位點(diǎn)的特異性PCR擴(kuò)增探針，在嚴(yán)格的條件下，只有在探針3'堿基與模板配對時(shí)PCR擴(kuò)增 反應(yīng)才能正常進(jìn)行，從而檢測出突變。通過設(shè)計(jì)兩個(gè)5'端探針，一個(gè)與正常DNA互補(bǔ)，一個(gè) 與突變DNA互補(bǔ)，對于純和性突變，分別加入兩種探針及3'端探針進(jìn)行兩個(gè)平行的PCR，結(jié) 合有與突變DNA完全互補(bǔ)的探針才可以延伸并得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0010] (5)等位基因特異的Taqman聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（competitive allele-specific TaqMan polymerase chain reaction，CAST-PCR)。CAST-PCR 法米用優(yōu)化 TaqMan 探針，通 過一段特異設(shè)計(jì)的MGB探針來阻止探針與野生型DNA結(jié)合，選擇性的優(yōu)先擴(kuò)增突變型DNA， 該檢測方法的靈敏度在1 %左右。
[0011] 因此，急需一種提高檢測kras基因的靈敏度的方法和相應(yīng)的檢測試劑盒，為腸癌 個(gè)體化用藥提供指導(dǎo)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供檢測kras基因突變的試劑盒，該試劑盒特異性 強(qiáng)且靈敏度高；本發(fā)明的目的之二在于提供檢測kras基因突變方法，該方法檢測周期短。
[0013] 為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0014] 檢測kras基因突變的試劑盒，所述試劑盒含有針對kras基因突變位點(diǎn)的LNA鎖 核酸修飾的特異探針。
[0015] 優(yōu)選的，所述鎖核酸修飾的特異探針的核苷酸序列為 GG+AGCT+G+GTG+GCGTAGGC_P04，其中" + "后的A或G為鎖核酸修飾堿基。
[0016] 優(yōu)選的，所述試劑盒中還包含檢測Kras基因突變的引物，所述引物的核苷酸序列 如 SEQ ID NO. 1 與 SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 2 與 SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 3 與 SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 4 與 SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 5 與 SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 6 與 SEQ ID NO. 8 或 SEQ ID NO. 7 與 SEQ ID NO. 8 所示。
[0017] 優(yōu)選的，所述試劑盒中還包括PCR緩沖液、dNTPs、Eva Green和二氯化鎂。
[0018] 優(yōu)選的，所述試劑盒中各組分的終濃度如下：1XPCR buffer、2. 5mM MgCl2、dNTP 250 μ M、引物 250nM、探針 500nM、I X EVE GREEN、DNA 聚合酶 IU 和 DNA 模板 2-20ng。
[0019] 2、所述檢測kras基因突變的試劑盒在非疾病診斷中檢測kras基因突變的方法， 包括如下步驟：
[0020] a.設(shè)計(jì)檢測kras基因突變的引物和針對kras基因突變位點(diǎn)的LNA鎖核酸修飾的 特異探針；
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