一種同時分離藤黃中四種藤黃酸類成分的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種同時分離藤黃中四種藤黃酸類成分 的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 藤黃科植物藤黃GarciniahanburyiHook.f.所分泌的膠狀樹脂，干燥后，呈圓柱 狀或不規(guī)則塊狀物，含藤黃酸、新藤黃酸、別藤黃酸等酸類成分。近年來，我國學(xué)者對中藥藤 黃中的活性成分做了大量的研宄。經(jīng)研宄發(fā)現(xiàn)，藤黃酸對多種腫瘤顯示較強(qiáng)的抗腫瘤活性， 并在有效劑量范圍內(nèi)毒副作用比較小，對腫瘤細(xì)胞的抑制有非常高的選擇性，能選擇性的 殺死癌細(xì)胞，而對正常動物造血系統(tǒng)和免疫功能沒有影響。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供了一種同時分離藤黃中四種藤黃酸類成分的方法，提高了 對藤黃的利用價值。
[0004] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：
[0005] -種同時分離藤黃中四種藤黃酸類成分的方法，包括如下步驟：
[0006]S1、將藤黃原藥材粉碎，定量稱取lKg，置于20L提取罐中，10L丙酮提取兩次，每次 3h，過濾，合并兩次的濾液，得提取液；
[0007]S2、將步驟S1所得的提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至800mL，得到藤黃丙酮濃縮液，加入 1600mL水，充分?jǐn)嚢枞芙?，室溫靜置24h后，過濾，得不溶物；
[0008]S3、往步驟S2所得的不溶物中加入40%的丙酮溶液，直至不溶物完全溶解后，過 高速離心機(jī)離心，得上清液；
[0009] S4、將步驟S3所得的上清液進(jìn)樣到已處理好的BS-16型大孔樹脂層析柱中，依次 用3倍柱體積的蒸餾水洗脫，3倍柱體積的40%丙酮洗脫，3倍柱體積的100%丙酮洗脫，得 藤黃酸類大孔樹脂洗脫液，濃縮至浸膏狀，用乙醇溶解（20g/100mL);
[0010] S5、取步驟S4所得的溶液采用制備液相色譜分離。用初始流動相平衡色譜柱 20min，每次進(jìn)樣體積5mL，按設(shè)定梯度洗脫，洗脫梯度見表1，紫外檢測器實(shí)時監(jiān)控，收集保 留時間為8.Omin、10. 3min、17min(為17. 5min與17. 9min的混合樣品）的3個組分；20min 以后，按照梯度初始比例平衡色譜柱，再次進(jìn)樣，共進(jìn)樣6次，將收集得到的洗脫組分按保 留時間合并相同部分，濃縮，減壓回收，室溫靜置8h，析出大量粉末，過濾，50°C干燥12小 時，得廣品；
[0011] S6、將步驟S5所得的保留時間為17min時所收集樣品，用乙醇溶解成濃度為 5mg/mL的樣品，在步驟S5所述條件下反復(fù)進(jìn)樣多次，每次進(jìn)樣體積lmL，收集保留時間為 17. 5min和17. 9min的流出液，流出液減壓濃縮，室溫靜置8h，析出粉末，過濾，50°C干燥12 小時，得R_藤黃酸和S-藤黃酸；
[0012] S7、所得各組份產(chǎn)品經(jīng)HPLC純度分析為98. 5 % ;分析條件為：C18 (5ym， 250mmX4. 6mm)，流動相為乙腈：水：磷酸=85 : 14. 8 : 0. 2,檢測波長為360nm，流速為lmL/min，柱溫為 25°C。
[0013] 其中，所述步驟S3中高速離心機(jī)的頻率為25000r/min。
[0014] 其中，所述步驟55中的色譜柱為(318(1〇11111，25〇111111\50臟）；紫外檢測波長為 360nm;洗脫流速為60mL/min;洗脫梯度為：洗脫劑米用乙腈-水-磷酸體系，首先用體積百 分比為70%的乙腈，體積百分比為0.2%的磷酸洗脫；再用體積百分比為80%的乙腈，體積 百分比為0. 2%的磷酸洗脫；最后用體積百分比為95%乙腈，體積百分比為0. 2%的磷酸洗 脫，20min完成一個分離周期。
[0015] 其中，所述步驟S5中的產(chǎn)品為：保留時間8.Omin為2a-羥基-3 0 -乙酰氧基白 樺脂酸，10. 3min為新藤黃酸，17min為R-藤黃酸和S-藤黃酸兩種異構(gòu)體的混合物。
[0016] 經(jīng)檢測：所得藤黃酸類各組份，保留時間8.Omin為2a-羥基-3 0 -乙酰氧基白樺 脂酸，10. 3min為新藤黃酸，17. 5min和17. 9min分別為R-藤黃酸和S-藤黃酸。
[0017] 本發(fā)明具有以下有益效果：
[0018] 本發(fā)明工藝簡單，可以獲得四種藤黃酸類成分，提高了對藤黃的利用價值。
【附圖說明】
[0019] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例中藤黃大孔樹脂丙酮洗脫部分的HPLC圖譜。
[0020]圖2為本發(fā)明實(shí)施例中藤黃中各種藤黃酸類單體成分分離的制備HPLC圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 為了使本發(fā)明的目的及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步 詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā) 明。
[0022] 本發(fā)明實(shí)施例提供了一種同時分離藤黃中四種藤黃酸類成分的方法，包括如下步 驟：
[0023] S1、將藤黃原藥材粉碎，定量稱取lKg，置于20L提取罐中，10L丙酮提取兩次，每次 3h，過濾，合并兩次的濾液，得提取液；
[0024] S2、將步驟S1所得的提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至800mL，得到藤黃丙酮濃縮液，加入 1600mL水，充分?jǐn)嚢枞芙猓覝仂o置24h后，過濾，得不溶物；
[0025] S3、往步驟S2所得的不溶物中加入40%的丙酮溶液，直至不溶物完全溶解后，過 高速離心機(jī)離心，離心機(jī)的頻率為25000r/min，得上清液；
[0026] S4、將步驟S3所得的上清液進(jìn)樣到已處理好的BS-16型大孔樹脂層析柱中，依次 用3倍柱體積的蒸餾水洗脫，3倍柱體積的40%丙酮洗脫，3倍柱體積100%丙酮洗脫，得藤 黃酸類大孔樹脂洗脫液，濃縮至浸膏狀，用乙醇溶解（20g/100mL);
[0027] S5、取步驟S4所得的溶液采用制備液相色譜分離。用初始流動相平衡色譜柱 20min，色譜柱為cl8 (10ym，250mmX50mm);紫外檢測波長為360nm;洗脫流速為60mL/min; 洗脫梯度如表1所示：洗脫劑采用乙腈-水-磷酸體系，首先用體積百分比為70 %的乙腈， 體積百分比為0. 2%的磷酸洗脫；再用體積百分比為80%的乙腈，體積百分比為0. 2%的磷 酸洗脫；最后用體積百分比為95 %乙腈，體積百分比為0. 2%的磷酸洗脫，20min完成一個 分離周期。
[0028]表1制備液相色譜的洗脫梯度
【主權(quán)項】
1. 一種同時分離藤黃中四種藤黃酸類成分的方法，其特征在于，包括如下步驟： 51、 將藤黃原藥材粉碎，定量稱取lKg，置于20L提取罐中，IOL丙酮提取兩次，每次3h， 過濾，合并兩次的濾液，得提取液； 52、 將步驟Sl所得的提取液減壓濃縮至800mL，得到藤黃丙酮濃縮液，加水1600mL，充 分?jǐn)嚢枞芙猓覝仂o置24h后，過濾，得不溶物； 53、 往步驟S2所得的不溶物中加入40%的丙酮溶液，直至不溶物完全溶解后，用高速 離心機(jī)離心，得上清液； 54、 將步驟S3所得的上清液進(jìn)樣到己處理好的BS-16型大孔樹脂層析柱中，依次用3 倍柱體積的蒸餾水洗脫，3倍柱體積40 %丙酮洗脫，3倍柱體積100 %丙酮洗脫，得藤黃酸類 大孔樹脂洗脫液，濃縮至浸膏狀，用乙醇溶解； 55、 取步驟S4所得的溶液采用制備液相色譜分離。首先用初始流動相平衡色譜 柱20min，每次進(jìn)樣體積5mL，按設(shè)定梯度洗脫，紫外檢測器實(shí)時監(jiān)控，收集保留時間為 8.OmirulO. 3min、17min(為 17. 5min與 17. 9min的混合樣品）的 3 個組分；20min以后，按 照梯度初始比例平衡色譜柱，再次進(jìn)樣，共進(jìn)樣6次，將收集得到的洗脫組分按保留時間合 并相同部分，濃縮，減壓回收，室溫靜置8h，析出大量粉末，過濾，50°C干燥12小時，得產(chǎn)品； 56、 將步驟S5所得的保留時間為17min時所收集樣品，用乙醇溶解成濃度為5mg/mL 的樣品，在步驟S5所述條件下反復(fù)進(jìn)樣多次，每次進(jìn)樣體積lmL，收集保留時間為17.Smin 和17. 9min的流出液，流出液減壓濃縮，室溫靜置8h，析出粉末，過濾，50°C干燥12小時，得 R-藤黃酸和S-藤黃酸； 57、 所得各組份產(chǎn)品經(jīng)HPLC純度分析為98. 5 % ;分析條件為：cl8(5ym， 250mmX4. 6mm)，流動相為乙腈：水：磷酸=85 : 14. 8 : 0. 2,檢測波長為360nm，流速為 lmL/min，柱溫為 25°C。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種同時分離藤黃中四種藤黃酸類成分的方法，其特征在 于，所述步驟S3中高速離心機(jī)的頻率為25000r/min。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種同時分離藤黃中四種藤黃酸類成分的方法，其特征在 于，所述步驟S5中的色譜柱為cl8 (10ym，250mmX50mm);紫外檢測波長為360nm;洗脫流 速為60mL/min;洗脫梯度為：洗脫劑采用乙腈-水-磷酸體系，首先用體積百分比為70% 的乙腈，體積百分比為0.2%的磷酸洗脫；再用體積百分比為80%的乙腈，體積百分比為 0. 2%的磷酸洗脫；最后用體積百分比為95%乙腈，體積百分比為0. 2%的磷酸洗脫，20min 完成一個分離周期。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種同時分離藤黃中四種藤黃酸類成分的方法，其特征在 于，所述步驟S5中的產(chǎn)品為：保留時間8.Omin為2a-羥基-3 0 -乙酰氧基白樺脂酸， 10. 3min為新藤黃酸，17min為R-藤黃酸和S-藤黃酸兩種異構(gòu)體的混合物。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種同時分離藤黃中四種藤黃酸類成分的方法，包括如下步驟：藤黃藥材粉碎后用丙酮提取得提取液，提取液減壓濃縮后加入水，充分?jǐn)嚢枞芙?，過濾，得不溶物；不容物用40％的丙酮溶液至完全溶解，離心，得上清液；將上清液進(jìn)樣到己處理好的BS-16型大孔樹脂層析柱中洗脫，得洗脫液，洗脫液濃縮至浸膏狀后，用乙醇溶解；采用制備液相色譜分離得四種藤黃酸類組分2α-羥基-3β-乙酰氧基白樺脂酸、新藤黃酸、R-藤黃酸和S-藤黃酸。本發(fā)明工藝簡單，可以同時獲得四種藤黃酸類成分，提高了對藤黃的利用價值。
【IPC分類】C07D493-20, C07J63-00
【公開號】CN104817569
【申請?zhí)枴緾N201510111176
【發(fā)明人】王曉玲, 唐少旗, 楊得鎖, 肖健
【申請人】寶雞文理學(xué)院
【公開日】2015年8月5日
【申請日】2015年3月7日