一種β-煙酰胺單核苷酸的純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及核苷酸類輔酶方法，尤其涉及一種β -煙酰胺單核苷酸的純化方法。
【背景技術(shù)】
[0002]β -煙酰胺單核苷酸(NMN)是輔酶I的合成底物，在被煙酰胺核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶腺苷化后即變成輔酶I (NAD)。在生物體內(nèi)NMN的水平和煙酰胺核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶(NAMPT)的活性直接影響到NAD的濃度，同時NMN直接參與體內(nèi)腺苷轉(zhuǎn)移，是體內(nèi)重要的一種合成底物和功能調(diào)節(jié)物質(zhì)。在治療應(yīng)用方面，NMN可以用于抗衰老、治療慢性病等，同時研宄表明NMN還對胰島素的分泌起到調(diào)節(jié)作用，對mRNA表達水平也有影響。因此，NMN在醫(yī)藥治療方面有著廣泛的應(yīng)用前景，同時也作為一種反應(yīng)底物在化工方面有著廣泛的市場前景。
[0003]NMN 一般應(yīng)用離子交換樹脂進行純化，由于其與多種類似物如NAD帶電荷和極性極為相近，分離純化有很大困難，無法將其中的類似物雜質(zhì)完全去除，所以離子交換法獲得的產(chǎn)品純度只有60%左右，收率只有40%，生產(chǎn)效率低下，不適合規(guī)?；a(chǎn)。
[0004]因此，現(xiàn)有技術(shù)還有待于改進和發(fā)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，本發(fā)明的目的在于提供一種β -煙酰胺單核苷酸的純化方法，旨在解決煙酰胺單核苷酸的純化過程中其他電荷和極性相近的類似物難以除盡，且產(chǎn)品純度低、收率低的問題。
[0006]為了達到上述目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案:
一種煙酰胺單核苷酸的純化方法，其中，包括以下步驟:
a、將經(jīng)過預處理的β-煙酰胺單核苷酸溶液用膜濃縮設(shè)備先后進行微濾和納濾，收集濃縮的粗品溶液；
b、將獲得的粗品溶液pH值調(diào)至3-7，進樣上反相高效液相色譜制備柱，固定相為十八烷基硅烷鍵合硅膠，流動相A為鹽酸溶液配成的pH3-7的溶液，流動相B為乙醇，進行梯度洗脫純化，得到純化的樣品溶液；
C、將純化的樣品溶液用膜濃縮設(shè)備進行納濾后，用真空冷凍干燥機凍干，獲得純化的β-煙酰胺單核苷酸。
[0007]所述的β -煙酰胺單核苷酸的純化方法，其中，所述步驟a中用于微濾的微濾膜孔徑為 0.2-1 μπι。
[0008]所述的β-煙酰胺單核苷酸的純化方法，其中，所述步驟a中用于納濾的納濾膜，其截留分子量為200。
[0009]所述的β -煙酰胺單核苷酸的純化方法，其中，所述步驟a中用于納濾的納濾膜為中空纖維膜。
[0010]所述的β -煙酰胺單核苷酸的純化方法，其中，所述步驟a中濃縮的粗品溶液的濃度為 20-30g/Lo
[0011]所述的β -煙酰胺單核苷酸的純化方法，其中，所述步驟c中純化的樣品溶液用膜濃縮設(shè)備進行納濾后的濃度為100~150g/L。
[0012]所述的煙酰胺單核苷酸的純化方法，其中，所述步驟b中按體積比計，流動相A:流動相B為2:98-1: I之間。
[0013]所述的煙酰胺單核苷酸的純化方法，其中，所述步驟c中用于納濾的納濾膜為截留分子量為200的中空纖維膜。
[0014]所述的煙酰胺單核苷酸的純化方法，其中，所述步驟b中，梯度洗脫時的洗脫時間為40min。
[0015]有益效果:本發(fā)明應(yīng)用十八烷基硅烷鍵合硅膠進行高效液相制備，對煙酰胺單核苷酸進行純化，使β -煙酰胺單核苷酸的純度可以達到98%，收率可以到達80%以上，生產(chǎn)效率也比其他工藝提高了2倍以上。有效解決了煙酰胺單核苷酸的純化過程中其他電荷和極性相近的類似物難以除盡的問題。
【具體實施方式】
[0016]本發(fā)明提供了一種煙酰胺單核苷酸的純化方法，為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及效果更加清楚、明確，以下對本發(fā)明進一步詳細說明。應(yīng)當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0017]本發(fā)明一種β -煙酰胺單核苷酸的純化方法的較佳實施例，其包括以下步驟: S100、將經(jīng)過預處理的β -煙酰胺單核苷酸溶液用膜濃縮設(shè)備先后進行微濾和納濾，
收集濃縮的粗品溶液；
S200、將獲得的粗品溶液pH值調(diào)至3-7，進樣上反相高效液相色譜制備柱，固定相為十八烷基硅烷鍵合硅膠，流動相A為鹽酸溶液配成的pH3-7的溶液，流動相B為乙醇，進行梯度洗脫純化，得到純化的樣品溶液；
S300、將純化的樣品溶液用膜濃縮設(shè)備進行納濾后，用真空冷凍干燥機凍干，獲得純化的煙酰胺單核苷酸。
[0018]本發(fā)明是采用反相高效液相色譜法對輔酶I的合成底物煙酰胺單核苷酸進行純化，通過以固定相為十八烷基硅烷鍵合硅膠，流動相為鹽酸配制而成的溶液和乙醇的色譜柱進行純化，再進一步濃縮及凍干，獲得純化的煙酰胺單核苷酸。本發(fā)明所述的β -煙酰胺單核苷酸的純化方法操作簡單，且能有效除去其他帶電荷和極性及其相似的類似物，使所制備出的煙酰胺單核苷酸純度高、收率大、產(chǎn)量大，適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
[0019]優(yōu)選地，所述步驟SlOO中用于微濾的微濾膜孔徑為0.2-1 μ mo具體而言，本發(fā)明步驟SlOO中用于微濾的微濾膜孔徑為0.5 μπι.微濾的基本原理是篩分過程，在靜壓差作用下濾除大于10 μπι的微粒，操作壓力為
0.7-7bar,原料液在壓差作用下，其中溶劑透過膜上的微孔流到膜的低壓側(cè)，大于膜孔的微粒被截留，從而實現(xiàn)原料液中的微粒與溶劑的分離。微濾過程對微粒的截留機理是篩分作用，決定膜的分離效果是膜的物理結(jié)構(gòu)、孔的形狀和大小。
[0020]本發(fā)明實施例中微濾時采用的微濾膜孔徑為0.5 μπι，能初步清除β -煙酰胺單核苷酸粗品溶液中較大的微生物及大顆粒分子，微濾膜允許大分子和溶解性固體(無機鹽)等通過，但會截留住懸浮物、細菌及大分子量膠體等物質(zhì)，對β-煙酰胺單核苷酸粗品溶液進行初步純化。微濾膜的孔徑過大，會使較大微生物和大顆粒分子透過微濾膜，影響初步過濾的效果；孔徑過小，會導致β-煙酰胺單核苷酸也無法透過微濾膜，造成產(chǎn)品的損失。
[0021]另外，本發(fā)明所述步驟SlOO中用于納濾的納濾膜，其截留分子量為200。進一步地，本發(fā)明較佳實施例中采用的納濾膜孔徑為1.5nm,能夠截留分子量為200的物質(zhì)。
[0022]更優(yōu)選地，所述步驟SlOO中用于納濾的納濾膜為中空纖維膜。
[0023]納濾是一種允許溶劑分子或某些低分子量溶質(zhì)或低價離子透過的過濾方法，其特點在于能在很低的壓力下具有較高的除鹽性能和截留分子量為數(shù)百的物質(zhì)。本發(fā)明采用孔徑為1.5nm的濾膜，其截留分子量為200，可以將分子量大于200的物質(zhì)過濾出來，初步過濾掉煙酰胺單核苷酸中的雜質(zhì)。并且，將中空纖維膜作為納濾膜，中空纖維膜外表為纖維狀，其具有自支撐作用，可以有效清除煙酰胺單核苷酸制備工藝中所產(chǎn)生的磷酸根殘留和其他小分子雜質(zhì)，使β-煙酰胺單核苷酸得到進一步純化。
[0024]經(jīng)過微濾和納濾后，收集濃縮的粗品溶液，其濃度為20_30g/L。
[0025]本發(fā)明較佳實施例中，所述步驟S200中磷酸溶液或鹽酸溶液的質(zhì)量濃度為2%~5%，乙醇溶液的質(zhì)量濃度為5%~30%.更優(yōu)選地，所述步驟S200中磷酸溶液或鹽酸溶液的體積用量為每毫升樣品溶液加5-20毫升磷酸溶液或鹽酸溶液，乙醇溶液的體積用量為每升流動相加100~400毫升乙醇溶液。
[0026]具體而言，磷酸溶液或鹽酸溶液的質(zhì)量濃度過高，會導致在梯度洗脫時洗出，若質(zhì)量濃度過低，會影響物質(zhì)的分離純化效果，本發(fā)明中采用質(zhì)量濃度為2%~5%的磷酸溶液或鹽酸溶液，可以保證其在梯度洗脫時不被析出的情況下達到高度純化β-煙酰胺單核苷酸的效果。
[0027]另外，改變酸的用量會影響峰形，從而影響到檢測效果。本發(fā)明實施例中采用體積用量為每毫升樣品溶液加5~20毫升的磷酸溶液或鹽酸溶液，體積用量為每升流動相加100-400毫升的乙醇溶液，可以使峰形對稱，減少拖尾現(xiàn)象。
[0028]本發(fā)明較佳實施例中，所述步驟S200用磷酸溶液或鹽酸溶液將上一步驟所初步純化的β -煙酰胺單核苷酸粗品溶液的pH值調(diào)至3-7，進樣上反相高效液相色譜制備柱，其流動相A為鹽酸溶液配成的pH3-7的溶液，流動相B為乙醇。
[0029]具體而言，反相高效液相色譜法中一般用非極性固定相(如C18、CS);而其流動相常為水或緩沖液，常加入甲醇、乙醇、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機溶劑以調(diào)節(jié)保留時間，其適用于分離非極性和極性較弱的化合物，并且PH會影響樣品存在的狀態(tài)，因而影響樣品的保留時間。本發(fā)明實施例中采用鹽酸配成的PH3-7的溶液和乙醇作為流動相，可以有效調(diào)節(jié)樣品的保留時間，使樣品從進入色譜柱到流出色譜柱的時間達到最優(yōu)化，能使樣品的分離效果良好。樣品的保留時間過長，會使檢測的靈敏度降低；樣品的保留時間過短，會使煙酰胺單核苷酸與雜質(zhì)的分離效果降低，影響煙酰胺單核苷酸的純化。
[0030]流動相的pH值應(yīng)該控制在2-8之間，pH值大于8時，可使載體硅膠即固定相溶解，pH小于2時，與硅膠化學鍵合相易水解脫落。本發(fā)明實施例中，pH值為3-7，此時β-煙酰胺單核苷酸能穩(wěn)定存在，其內(nèi)部結(jié)構(gòu)不會被破壞，在此條件下，可以使樣品的分離效果達到最優(yōu)化。更優(yōu)選地，本發(fā)明中的流動相的PH值為5，此時樣品的純化效果最佳。<