寡肽cd08及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)領(lǐng)域,特別涉及寡肽及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 寡肽是多肽的一種分類,分子量段一般在1000道爾頓以下,也稱作小肽,一般由 2-6個(gè)氨基酸組成。
[0003] 炎癥是具有血管系統(tǒng)的活體組織對(duì)損傷因子所發(fā)生的防御反應(yīng)。對(duì)機(jī)體的損傷的 局部組織所呈現(xiàn)的反應(yīng)稱為炎癥反應(yīng),炎癥發(fā)展后期會(huì)產(chǎn)生滲出液,滲出物的壓迫和炎癥 介質(zhì)的作用可引起患者疼痛?,F(xiàn)在抗炎的臨床應(yīng)用藥物主要為化學(xué)合成藥物,如萘丁美 酮、吲哚美辛、吡羅昔康、布洛芬等,這些化學(xué)藥物雖然抗炎效果明顯,但不能治本,不能 消除致炎的基本原因,大多都有較嚴(yán)重的不良反應(yīng),給患者造成痛苦和損失。
[0004] 創(chuàng)面修復(fù),創(chuàng)面是正常皮膚(組織)在外界致傷因子如外科手術(shù)、外力、熱、電流、化 學(xué)物質(zhì)、低溫以及機(jī)體內(nèi)在因素如局部血液供應(yīng)障礙等作用下所導(dǎo)致的損害。常伴有皮膚 完整性的破壞以及一定量正常組織的丟失,同時(shí),皮膚的正常功能受損。也稱為傷口或者創(chuàng) 傷。創(chuàng)面修復(fù)既傷口修復(fù)。
[0005] 消化道潰瘍病,胃潰瘍、十二指腸潰瘍統(tǒng)稱為消化道潰瘍病。由于生活節(jié)奏加快, 工作壓力加大,近年消化道潰瘍病的發(fā)病率不僅未見(jiàn)下降,反有上升趨勢(shì)。近10多年來(lái)本 病的癥狀也變得不典型,無(wú)規(guī)律的胃部隱痛常引不起人們的注意,直到發(fā)生嘔血或黑便時(shí) 方到醫(yī)院就診。消化性潰瘍主要指發(fā)生在胃和十二指腸的慢性潰瘍,亦可發(fā)生于食管下段、 胃空腸吻合口周圍及含有異位胃粘膜的美克爾(MECKEL)憩室。這些潰瘍的形成與胃酸和 胃蛋白酶的消化作用有關(guān),故稱消化性潰瘍。近年研究發(fā)現(xiàn)潰瘍的形成與幽門螺旋桿菌(H P)的存在有關(guān)。本病絕大多數(shù)(95%以上)位于胃和十二指腸,故又稱胃十二指腸潰瘍。本 病的總發(fā)病率占人口的5-10%,十二指腸潰瘍較胃潰瘍多見(jiàn),以青壯年多發(fā),男多于女,兒 童亦可發(fā)病,老年患者所占比例亦逐年有所增。由于復(fù)發(fā)率很高,給患者帶來(lái)痛苦。
[0006] 免疫力是人體自身的防御機(jī)制,是人體識(shí)別和消滅外來(lái)侵入的任何異物(病毒、細(xì) 菌等);處理衰老、損傷、死亡、變性的自身細(xì)胞以及識(shí)別和處理體內(nèi)突變細(xì)胞和病毒感染細(xì) 胞的能力?,F(xiàn)代免疫學(xué)認(rèn)為,免疫力是人體識(shí)別和排除"異己"的生理反應(yīng)。年老體弱的人 員由于自身免疫系統(tǒng)較弱,所以需要提高細(xì)胞的識(shí)別能力。免疫力低下是會(huì)造成人體容易 受到外界的感染,功能下降。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007] 為了尋找一種可以多角度保護(hù)人體創(chuàng)面和抗炎鎮(zhèn)痛,同時(shí)提高人體免機(jī)能的藥 物,發(fā)明人通過(guò)大量合成試驗(yàn),廣泛的篩選,采用Fmoc保護(hù)的氨基酸來(lái)合成,得到大量寡肽 分子,其中部分寡肽分子獲得了意想不到的技術(shù)效果。意外地發(fā)現(xiàn)治療效果較好的寡肽 ⑶08:由E、Y2個(gè)氨基酸殘基組成,分子量為310. 31Da,其氨基酸序列如SEQID:1所示。
[0008] 上述寡肽的制備方法可以使用合成,也可以采用從生物體中提取純化得到。發(fā)明 提供一種寡肽的制備方法,其特征在于包括如下的步驟:
[0009]a.合成順序?yàn)閺腃端到N端;取1倍摩爾當(dāng)量的樹(shù)脂放入多肽合成儀反應(yīng)器中, 加入DCM(二氯甲烷)溶脹半小時(shí),然后抽掉DCM,加入序列中第一個(gè)Fmoc保護(hù)的氨基酸 10mmol,2倍摩爾當(dāng)量的DIEA(二異丙基乙胺),適量的DMF(二甲基甲酰胺)、DCM溶液(適 量是指以可使樹(shù)脂充分鼓動(dòng)起來(lái)為宜),用氮?dú)夤呐莘磻?yīng)60min;然后加入約5倍摩爾當(dāng)量 甲醇,反應(yīng)半小時(shí),抽掉反應(yīng)液,用DMF、甲醇洗凈;
[0010]b.加入適量哌啶去除Fmoc(9-芴甲氧羰基)保護(hù)基,洗凈,茚三酮檢測(cè);
[0011]c.往反應(yīng)器中加入序列中第二個(gè)氨基酸(也為2倍摩爾當(dāng)量),2倍摩爾當(dāng)量HBTU(苯并三氮唑-N,N,N',N' -四甲基脲六氟磷酸鹽)及DIEA,氮?dú)夤呐莘磻?yīng)半小時(shí);
[0012]d.抽掉液體,用DMF洗凈,茚三酮檢測(cè);
[0013]e.將樹(shù)脂用氮?dú)獯蹈珊?,從反?yīng)柱中取下并稱取重量,倒入燒瓶中,然后往燒瓶中 加一定量的95%TFA(三氟乙酸)切割液,震蕩反應(yīng)2h,目的是將多肽從樹(shù)脂載體上裂解下來(lái) 并去除氨基酸的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán);
[0014]f.濾掉樹(shù)脂,得到濾液,然后向?yàn)V液中加入大量乙醚,析出粗產(chǎn)物,然后離心,清洗 即可得到該序列的粗產(chǎn)物;
[0015] g.分析提純和質(zhì)譜檢測(cè):用ESI(電噴霧電離)離子源質(zhì)譜儀和測(cè)序儀檢測(cè)該序列 的正確性,用高效液相色譜將粗品提純至要求純度;
[0016] h.收集純化好的目標(biāo)寡肽溶液放入凍干機(jī)中進(jìn)行濃縮,凍干成白色粉末。
[0017] 本發(fā)明提供的寡肽可作為普通食品、保健品或者藥品的組成部分。本發(fā)明還提供 一種寡肽的組合物,其中含有藥學(xué)可以接受的載體。組合物可以以藥物制劑形式存在,優(yōu)選 的是注射劑,更優(yōu)選的是冷凍干燥注射劑,該藥物制劑形式藥物組合物,可以按照制劑學(xué)常 規(guī)技術(shù)制備,包括將藥物活性成分,本發(fā)明的寡肽與藥物載體混合,按照制劑學(xué)常規(guī)技術(shù)制 成所需要的劑型。
[0018] 本發(fā)明中的寡肽,分子量小、人工合成方便、純度很高,生產(chǎn)方面,適合大規(guī)模生 產(chǎn),在應(yīng)用方面,這些寡肽抗炎鎮(zhèn)痛效果明顯,對(duì)創(chuàng)面損傷、燒傷、燙傷、消化道潰瘍具有顯 著的治療效果;該寡肽還有能提高動(dòng)物免疫機(jī)能的作用,寡肽能夠在制備抗菌、抗炎鎮(zhèn)痛、 抗腫瘤和提高免疫力的藥物中的應(yīng)用。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 以下是結(jié)合具體試驗(yàn)對(duì)本發(fā)明的說(shuō)明,并不是對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。實(shí)施例 1本發(fā)明中寡肽的制備方法
[0020]原料:樹(shù)脂(WangResin),Fmoc保護(hù)的氨基酸,
[0021] 試劑:N,N-二甲基酰胺(DMF),DCM,ME0H,乙酸酐,吡啶,DIEA,HBTU,六氫吡啶
[0022] 儀器:十二通道半自動(dòng)多肽合成儀,高效液相色譜(HPLC),型號(hào):Waters2695檢測(cè) 試劑:苯酚試劑,吡啶,茚三酮試劑
[0023] (1)合成順序?yàn)閺腃端到N端。
[0024](2)取lOmmol當(dāng)量的樹(shù)脂放入多肽合成儀反應(yīng)器中,加入DCM(二氯甲烷)溶脹 半小時(shí),然后抽掉DCM,加入序列中第一個(gè)Fmoc保護(hù)的氨基酸lOmmol,20mmol的DIEA(二 異丙基乙胺),適量的DMF(二甲基甲酰胺)、DCM溶液(適量是指以可使樹(shù)脂充分鼓動(dòng)起來(lái) 為宜),用氮?dú)夤呐莘磻?yīng)60min。然后加入約50mmol當(dāng)量甲醇,反應(yīng)半小時(shí),抽掉反應(yīng)液,用DMF、甲醇洗凈。
[0025] (3)加入適量哌啶去除Fmoc(9-芴甲氧羰基)保護(hù)基,洗凈,茚三酮檢測(cè)。
[0026] (4)往反應(yīng)器中加入序列中第二個(gè)氨基酸(也為20mmol),20mmolHBTU(苯并三氮 唑-N,N,N',N' -四甲基脲六氟磷酸鹽)及DIEA,氮?dú)夤呐莘磻?yīng)半小時(shí)。
[0027] (5)抽掉液體,用DMF洗凈,茚三酮檢測(cè)。
[0028] (6)將樹(shù)脂用氮?dú)獯蹈珊螅瑥姆磻?yīng)柱中取下并稱取重量,倒入燒瓶中,然后往燒瓶 中加一定量的95%TFA(三氟乙酸)切割液,震蕩反應(yīng)2h,目的是將多肽從樹(shù)脂載體上裂解下 來(lái)并去除氨基酸的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)。
[0029] (7)濾掉樹(shù)脂,得到濾液,然后向?yàn)V液中加入大量乙醚,析出粗產(chǎn)物,然后離心,清 洗即可得到該序列的粗產(chǎn)物。
[0030] (8)分析提純和質(zhì)譜檢測(cè):用ESI(電噴霧電離)離子源質(zhì)譜儀檢測(cè)該序列分子量 的正確性,用高效液相色譜將粗品提純至要求純度。
[0031] (9)收集純化好的目標(biāo)寡肽溶液放入凍干機(jī)中進(jìn)行濃縮,凍干成白色粉末。
[0032] 實(shí)施例2寡肽對(duì)小鼠耳廓腫脹程度的影響,抗炎消腫鎮(zhèn)痛的作用
[0033] 取昆明種小鼠,雌雄各半,體重25_30g,按樣品量隨機(jī)分組:每組10只。 HY01-HY24(250mg/kg)(2mg/ml)、萘丁美酮(250mg/kg)、生理鹽水對(duì)照組(0?lml/10g)粗提 物劑量均折算為原動(dòng)物生藥劑量(下同)。各組均經(jīng)口灌胃給藥,對(duì)照組經(jīng)口灌胃生理鹽 水。各組每天灌胃1次,連續(xù)4d,末次灌胃2h后,尾靜脈注射Evan'sblue50mg/kg,于 小鼠右耳雙面涂二甲苯25ul/面,20h后,拉頸處死小鼠,沿耳廓基線剪下雙耳,用直徑 7. 5mm的打孔器分別在雙耳同一部位打下圓耳片,電子天平稱重,求出重量差,用以表示 腫脹度(腫脹度=左耳耳片重-右耳耳片重)。按以下公式計(jì)算腫脹抑制百分率。
[0034]抑制率(%) =(對(duì)照組平均腫脹度-給藥組平均腫脹度)/對(duì)照組平均腫脹度*100%。
[0035]表1
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種寡肽⑶08,其特征在于:由E、Y2個(gè)氨基酸殘基組成,分子量為310. 31Da,其 氨基酸序列如SEQID: 1所示。
2. -種權(quán)利要求1所述寡肽的制備方法,其特征在于包括如下的步驟: a. 合成順序?yàn)閺腃端到N端;取1倍摩爾當(dāng)量的樹(shù)脂放入多肽合成儀反應(yīng)器中,加入 DCM(二氯甲烷)溶脹半小時(shí),然后抽掉DCM,加入序列中第一個(gè)Fmoc保護(hù)的氨基酸IOmmol, 2倍摩爾當(dāng)量的DIEA(二異丙基乙胺),適量的DMF(二甲基甲酰胺)、DCM溶液(適量是指以 可使樹(shù)脂充分鼓動(dòng)起來(lái)為宜),用氮?dú)夤呐莘磻?yīng)60min;然后加入約5倍摩爾當(dāng)量甲醇,反應(yīng) 半小時(shí),抽掉反應(yīng)液,用DMF、甲醇洗凈; b. 加入適量哌啶去除Fmoc(9-芴甲氧羰基)保護(hù)基,洗凈,茚三酮檢測(cè); c. 往反應(yīng)器中加入序列中第二個(gè)氨基酸(也為2倍摩爾當(dāng)量),2倍摩爾當(dāng)量HBTU(苯 并三氮唑-N,N,N',N' -四甲基脲六氟磷酸鹽)及DIEA,氮?dú)夤呐莘磻?yīng)半小時(shí); d. 抽掉液體,用DMF洗凈,茚三酮檢測(cè); e. 將樹(shù)脂用氮?dú)獯蹈珊?,從反?yīng)柱中取下并稱取重量,倒入燒瓶中,然后往燒瓶中加一 定量的95%TFA(三氟乙酸)切割液,震蕩反應(yīng)2h,目的是將多肽從樹(shù)脂載體上裂解下來(lái)并 去除氨基酸的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán); f. 濾掉樹(shù)脂,得到濾液,然后向?yàn)V液中加入大量乙醚,析出粗產(chǎn)物,然后離心,清洗即可 得到該序列的粗產(chǎn)物; g. 分析提純和質(zhì)譜檢測(cè):用ESI(電噴霧電離)離子源質(zhì)譜儀檢測(cè)該序列分子量的正確 性,用高效液相色譜將粗品提純至要求純度; h. 收集純化好的目標(biāo)寡肽溶液放入凍干機(jī)中進(jìn)行濃縮,凍干成白色粉末。
3. -種如權(quán)利要求1所述的寡肽在制備抗炎或鎮(zhèn)痛藥物中的應(yīng)用。
4. 一種如權(quán)利要求1所述的寡肽在制備修復(fù)創(chuàng)面藥物中的應(yīng)用。
5. -種如權(quán)利要求1所述的寡肽在制備治療皮膚外傷藥物中的應(yīng)用。
6. -種如權(quán)利要求1所述的寡肽在制備治療消化道潰瘍藥物中的應(yīng)用。
7. -種如權(quán)利要求1所述的寡肽在制備提高免疫藥物中的應(yīng)用。
8. 權(quán)利要求1所述的寡肽可作為普通食品、保健品或者藥品的組成部分。
9. 含有權(quán)利要求1所述的一種或多種寡肽的組合物,其中含有藥學(xué)可以接受的載體。
10. 權(quán)利要求9所述的組合物可以以藥物制劑形式存在,優(yōu)選的是注射劑,更優(yōu)選的是 冷凍干燥注射劑,該藥物制劑形式藥物組合物,可以按照制劑學(xué)常規(guī)技術(shù)制備,包括將藥物 活性成分,本發(fā)明的寡肽與藥物載體混合,按照制劑學(xué)常規(guī)技術(shù)制成所需要的劑型。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一個(gè)小分子寡肽及其制備方法,具體是寡肽CD08及其制備方法和應(yīng)用,本發(fā)明公開(kāi)了寡肽的氨基酸序列如SEQ ID:1所示,可以采用合成,提取或者基因工程等方式制備寡肽CD08,在制備治療抗炎鎮(zhèn)痛、創(chuàng)面修復(fù)以及提高免疫的藥物中有較好的治療效果。
【IPC分類】A23L1-29, C07K5-072, A61P29-00, C07K1-04, A61K38-05, C07K1-06, A61P17-02, A61P37-04, A61P31-00, A61P35-00, A61P1-04
【公開(kāi)號(hào)】CN104817614
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410044249
【發(fā)明人】陳光健
【申請(qǐng)人】陳光健
【公開(kāi)日】2015年8月5日
【申請(qǐng)日】2014年1月30日