寡肽cd13及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)領(lǐng)域，特別涉及寡肽及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 寡肽是多肽的一種分類，分子量段一般在1000道爾頓以下，也稱作小肽，一般由 2-6個氨基酸組成。
[0003] 炎癥是具有血管系統(tǒng)的活體組織對損傷因子所發(fā)生的防御反應(yīng)。對機(jī)體的損傷的 局部組織所呈現(xiàn)的反應(yīng)稱為炎癥反應(yīng)，炎癥發(fā)展后期會產(chǎn)生滲出液，滲出物的壓迫和炎癥 介質(zhì)的作用可引起患者疼痛。現(xiàn)在抗炎的臨床應(yīng)用藥物主要為化學(xué)合成藥物，如萘丁美 酮、吲哚美辛、吡羅昔康、布洛芬等，這些化學(xué)藥物雖然抗炎效果明顯，但不能治本，不能 消除致炎的基本原因，大多都有較嚴(yán)重的不良反應(yīng)，給患者造成痛苦和損失。
[0004] 創(chuàng)面修復(fù)，創(chuàng)面是正常皮膚(組織）在外界致傷因子如外科手術(shù)、外力、熱、電流、化 學(xué)物質(zhì)、低溫以及機(jī)體內(nèi)在因素如局部血液供應(yīng)障礙等作用下所導(dǎo)致的損害。常伴有皮膚 完整性的破壞以及一定量正常組織的丟失，同時，皮膚的正常功能受損。也稱為傷口或者創(chuàng) 傷。創(chuàng)面修復(fù)既傷口修復(fù)。
[0005] 消化道潰瘍病，胃潰瘍、十二指腸潰瘍統(tǒng)稱為消化道潰瘍病。由于生活節(jié)奏加快， 工作壓力加大，近年消化道潰瘍病的發(fā)病率不僅未見下降，反有上升趨勢。近10多年來本 病的癥狀也變得不典型，無規(guī)律的胃部隱痛常引不起人們的注意，直到發(fā)生嘔血或黑便時 方到醫(yī)院就診。消化性潰瘍主要指發(fā)生在胃和十二指腸的慢性潰瘍，亦可發(fā)生于食管下段、 胃空腸吻合口周圍及含有異位胃粘膜的美克爾（MECKEL)憩室。這些潰瘍的形成與胃酸和 胃蛋白酶的消化作用有關(guān)，故稱消化性潰瘍。近年研究發(fā)現(xiàn)潰瘍的形成與幽門螺旋桿菌（H P)的存在有關(guān)。本病絕大多數(shù)（95%以上)位于胃和十二指腸，故又稱胃十二指腸潰瘍。本 病的總發(fā)病率占人口的5-10%，十二指腸潰瘍較胃潰瘍多見，以青壯年多發(fā)，男多于女，兒 童亦可發(fā)病，老年患者所占比例亦逐年有所增。由于復(fù)發(fā)率很高，給患者帶來痛苦。
[0006] 免疫力是人體自身的防御機(jī)制，是人體識別和消滅外來侵入的任何異物(病毒、細(xì) 菌等）；處理衰老、損傷、死亡、變性的自身細(xì)胞以及識別和處理體內(nèi)突變細(xì)胞和病毒感染細(xì) 胞的能力?，F(xiàn)代免疫學(xué)認(rèn)為，免疫力是人體識別和排除"異己"的生理反應(yīng)。年老體弱的人 員由于自身免疫系統(tǒng)較弱，所以需要提高細(xì)胞的識別能力。免疫力低下會造成人體容易受 到外界的感染，功能下降。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]為了尋找一種可以多角度保護(hù)人體創(chuàng)面和抗炎鎮(zhèn)痛，同時提高人體免機(jī)能的藥 物，發(fā)明人通過大量合成試驗(yàn)，廣泛的篩選，采用Fmoc保護(hù)的氨基酸來合成，得到大量寡肽 分子，其中部分寡肽分子獲得了意想不到的技術(shù)效果。意外地發(fā)現(xiàn)寡肽CD13治療效果較 好：寡肽⑶13由H、L、E3個氨基酸殘基組成，分子量為397.43Da，其氨基酸序列如SEQID:1 所示。
[0008] 上述寡肽的制備方法可以使用合成，也可以采用從生物體中提取純化得到。寡肽 的制備方法，其特征在于包括如下的步驟：
[0009]a.合成順序?yàn)閺腃端到N端；取1倍摩爾當(dāng)量的樹脂放入多肽合成儀反應(yīng)器中， 加入DCM(二氯甲烷）溶脹半小時，然后抽掉DCM，加入序列中第一個Fmoc保護(hù)的氨基酸 10mmol，2倍摩爾當(dāng)量的DIEA(二異丙基乙胺），適量的DMF(二甲基甲酰胺）、DCM溶液(適 量是指以可使樹脂充分鼓動起來為宜)，用氮?dú)夤呐莘磻?yīng)60min;然后加入約5倍摩爾當(dāng)量 甲醇，反應(yīng)半小時，抽掉反應(yīng)液，用DMF、甲醇洗凈；
[0010]b.加入適量哌啶去除Fmoc(9-芴甲氧羰基）保護(hù)基，洗凈，茚三酮檢測；
[0011] c.往反應(yīng)器中加入序列中第二個氨基酸（也為2倍摩爾當(dāng)量)，2倍摩爾當(dāng)量HBTU(苯并三氮唑-N，N，N'，N' -四甲基脲六氟磷酸鹽）及DIEA，氮?dú)夤呐莘磻?yīng)半小時，抽掉液體， 用DMF，甲醇洗凈，茚三酮檢測；
[0012]d.重復(fù)依步驟b、c的方式依次加入序列中氨基酸，抽掉液體，用DMF洗凈，茚三酮 檢測；
[0013]e.將樹脂用氮?dú)獯蹈珊?，從反?yīng)柱中取下并稱取重量，倒入燒瓶中，然后往燒瓶中 加一定量的95%TFA(三氟乙酸)切割液，震蕩反應(yīng)2h，目的是將多肽從樹脂載體上裂解下來 并去除氨基酸的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)；
[0014]f.濾掉樹脂，得到濾液，然后向?yàn)V液中加入大量乙醚，析出粗產(chǎn)物，然后離心，清洗 即可得到該序列的粗產(chǎn)物；
[0015] g.分析提純和質(zhì)譜檢測：用ESI(電噴霧電離)離子源質(zhì)譜儀和測序儀檢測該序列 的正確性，用高效液相色譜將粗品提純至要求純度；
[0016] h.收集純化好的目標(biāo)寡肽溶液放入凍干機(jī)中進(jìn)行濃縮，凍干成白色粉末。
[0017] 本發(fā)明提供的寡肽可作為普通食品、保健品或者藥品的組成部分。本發(fā)明還提供 一種寡肽的組合物，其中含有藥學(xué)可以接受的載體。組合物可以以藥物制劑形式存在，優(yōu)選 的是注射劑，更優(yōu)選的是冷凍干燥注射劑，該藥物制劑形式藥物組合物，可以按照制劑學(xué)常 規(guī)技術(shù)制備，包括將藥物活性成分，本發(fā)明的寡肽與藥物載體混合，按照制劑學(xué)常規(guī)技術(shù)制 成所需要的劑型。
[0018] 本發(fā)明中的寡肽，分子量小、人工合成方便、純度很高，生產(chǎn)方面，適合大規(guī)模生 產(chǎn)，在應(yīng)用方面，這些寡肽抗炎鎮(zhèn)痛效果明顯，對創(chuàng)面損傷、燒傷、燙傷、消化道潰瘍具有顯 著的治療效果；該寡肽還有能提高動物免疫機(jī)能的作用，寡肽能夠在制備抗菌、抗炎鎮(zhèn)痛、 抗腫瘤和提高免疫力的藥物中的應(yīng)用。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 以下是結(jié)合具體試驗(yàn)對本發(fā)明的說明，并不是對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。實(shí)施例 1本發(fā)明中寡肽的制備方法
[0020]原料：樹脂（WangResin),Fmoc保護(hù)的氨基酸，
[0021] 試劑：N,N-二甲基酰胺（DMF)，DCM，ME0H，乙酸酐，吡啶，DIEA，HBTU，六氫吡啶
[0022] 儀器：十二通道半自動多肽合成儀，高效液相色譜（HPLC)，型號：Waters2695檢測 試劑：苯酚試劑，吡啶，茚三酮試劑
[0023] (1)合成順序?yàn)閺腃端到N端。
[0024] (2)取lOmmol當(dāng)量的樹脂放入多肽合成儀反應(yīng)器