低溫蛋白酶生產(chǎn)菌及該菌產(chǎn)生的低溫蛋白酶和該酶的基因的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物及微生物酶制劑領(lǐng)域，具體涉及一株來源于深海沉積物的低溫 蛋白酶產(chǎn)生菌、所產(chǎn)蛋白酶以及利用該菌株產(chǎn)生低溫蛋白酶的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 低溫蛋白酶是指最適催化溫度在40°C以下，并且在20~30°C之間仍能保持較高 酶活（50 %以上）的一類蛋白水解酶，由于其最適催化溫度接近自然環(huán)境中的溫度，因此在 應(yīng)用過程中可省去加熱或冷卻過程，與中高溫蛋白酶相比具有節(jié)能、省時(shí)等特點(diǎn)，在食品及 洗滌行業(yè)具有廣泛的應(yīng)用前景。低溫蛋白酶多數(shù)來源于冰川、極地、高山、深海等低溫環(huán)境 中的嗜低溫或耐低溫微生物。這些低溫微生物為了適應(yīng)其所處的低溫環(huán)境，?？杀磉_(dá)分泌 一些在低溫條件下仍具有較高催化活性的胞外酶或胞內(nèi)酶，因此從耐低溫或嗜低溫微生物 中，篩選獲得低溫蛋白酶已成為發(fā)掘新型工業(yè)用低溫酶制劑的主要方法。
[0003]目前已發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)低溫蛋白酶菌株有來源于冰川凍土中的地衣芽孢桿菌 (Bacilluslicheniformis)和短小桿菌（Curtobacteriumluteum)、來源于南極地區(qū) 的梭狀芽抱桿菌（Clostridiumsp.)和嗜冷桿菌（Psychrobacterproteolyticus)、 來源于海洋浮冰中的科爾韋爾氏菌屬（Colwelliasp.)、來源于寒漠地區(qū)的微小桿菌 (Exiguobacteriumsp.)以及來源于其它寒冷環(huán)境中的沙雷氏菌（Serratiasp.)、弧菌 (Vibriosp.)、黃單胞菌（Xanthomonasmaltophilia)、希瓦氏菌屬（Shewanellasp.)產(chǎn)黃 青霉（Penicilliumchrysogenum)等。這些菌株所產(chǎn)低溫蛋白酶的最適催化溫度大部分均 在30~40°C之間，只有少數(shù)幾種的最適催化溫度低于20°C，但穩(wěn)定性很差。
[0004] 國內(nèi)對(duì)低溫蛋白酶及其產(chǎn)生菌的研宄起步較晚，研宄對(duì)象多集中在來源于冰川及 凍土中的Pseudomonas屬、Xanthomonas屬、Aeromonas屬等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種低溫蛋白酶生產(chǎn)菌及該菌產(chǎn)生的低溫蛋白酶和該 酶的基因，該菌株來源于南印度洋深海沉積物，經(jīng)16SrRNA序列分析，鑒定為動(dòng)性球菌 (Planococcussp.)，該酶基因序列見序列1，該菌株保藏編號(hào)為：CGMCCNo. 8088,本菌株作 為低溫蛋白酶生產(chǎn)菌株具有較大的優(yōu)勢(shì)，具有發(fā)酵條件易于控制、發(fā)酵原料簡(jiǎn)單易得、生長(zhǎng) 快、發(fā)酵周期短、抗噬菌體及雜菌污染的能力較強(qiáng)、菌株產(chǎn)酶較為穩(wěn)定的顯著優(yōu)點(diǎn)。
[0006] 本發(fā)明實(shí)現(xiàn)目的的技術(shù)方案是：
[0007] -株低溫蛋白酶生產(chǎn)菌，所述菌株保藏日期為2013年08月29日，保藏單位為：中 國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為：CGMCCNo. 8088,地址：北京市 朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，分類命名為：動(dòng)性球菌Planococcussp.。
[0008] 而且，所述菌株能夠利用葡萄糖、果糖、淀粉作為碳源，能夠利用硫酸銨、蛋白胨、 水解酪蛋白作為氮源；具有氧化酶、過氧化氫酶活性，明膠液化實(shí)驗(yàn)呈陽性，在含有酪蛋白 的4~20°C低溫平板上產(chǎn)生明顯的透明圈。
[0009] -種低溫蛋白酶基因，其成熟肽編碼序列、信號(hào)肽編碼序列以及編碼區(qū)上游的部 分表達(dá)調(diào)控序列如序列1所示。
[0010] 一種低溫蛋白酶，由低溫蛋白酶生產(chǎn)菌菌株發(fā)酵獲得。
[0011] 一種低溫蛋白酶，經(jīng)由序列1所述的基因表達(dá)獲得。
[0012] 一種產(chǎn)低溫蛋白酶的基因工程，含有序列1所述的低溫蛋白酶基因。
[0013] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果為：
[0014] 1、本菌株作為低溫蛋白酶生產(chǎn)菌株具有較大的優(yōu)勢(shì)：⑴發(fā)酵條件易于控制，該菌 株的最適生長(zhǎng)溫度與最佳產(chǎn)酶溫度均接近于自然環(huán)境中的溫度，因此在發(fā)酵過程中可省去 加熱或冷卻的過程，另外，該菌株的生長(zhǎng)受pH值影響較小，在pH6. 0-8. 0之間均可穩(wěn)定生長(zhǎng) 并產(chǎn)酶；⑵發(fā)酵原料簡(jiǎn)單易得，蛋白酶產(chǎn)量高，該菌株可在含有酪蛋白及海鹽的培養(yǎng)基上進(jìn) 行快速生長(zhǎng)繁殖，搖瓶發(fā)酵48h蛋白酶產(chǎn)量可達(dá)280-360U/mL;(3)生長(zhǎng)快、發(fā)酵周期短，該菌 株在適宜生長(zhǎng)條件下的代時(shí)約為30-40min，可與大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等快速繁殖菌種 相媲美；⑷抗噬菌體及雜菌污染的能力較強(qiáng)；(5)菌株產(chǎn)酶較為穩(wěn)定，產(chǎn)酶量基本與菌體生 長(zhǎng)量成正比。
[0015] 2、從對(duì)該菌株所產(chǎn)蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)分析結(jié)果來看，該菌株所產(chǎn)蛋白酶應(yīng)屬典 型的絲氨酸蛋白酶，其最適催化溫度為37°C左右，在25-30°C之間可保持較高的催化活 性；由于人體的正常溫度也在36-37°C之間，因此在牙膏或化妝品中添加該酶有望起到最 佳催化效果；該酶屬典型的低溫蛋白酶，與中/高溫蛋白酶相比，熱穩(wěn)定性較差，50°C僅保 溫1.Omin，則酶活完全喪失；該特性盡管不利于酶的儲(chǔ)存和運(yùn)輸，但在食品、啤酒及奶制 品加工工業(yè)中卻有著較大的應(yīng)用前景，因?yàn)樵谄浼庸み^程中，往往需要蛋白酶的滅活以保 證食品、啤酒及奶制品的風(fēng)味和質(zhì)量；中高溫蛋白酶的滅活非常困難往往需要較高的溫度 和較長(zhǎng)的時(shí)間，對(duì)產(chǎn)品影響較大；而低溫蛋白酶，則只需較低的溫度（50°C)和較短的時(shí)間 (l-5min)就可使蛋白酶完全失活，因此低溫蛋白酶的使用不僅節(jié)能、省時(shí)，還可充分保障食 品、啤酒及奶制品中的獨(dú)特風(fēng)味和質(zhì)量。
【附圖說明】
[0016]圖1為本發(fā)明蛋白酶的最適作用溫度；
[0017] 圖2為本發(fā)明蛋白酶的最適作用pH;
[0018] 圖3為本發(fā)明蛋白酶的熱穩(wěn)定性。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳述，以下實(shí)施例只是描述性的，不是限 定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0020] -、菌株?duì)顟B(tài)說明：本發(fā)明提供一種可高產(chǎn)低溫蛋白酶的海洋細(xì)菌動(dòng)性球菌 TCCC11813 (CGMCCNo. 8088)。該菌株來源于南印度洋深海沉積物，經(jīng)16SrRNA序列分析，鑒 定為動(dòng)性球菌（Planococcussp.)。該菌株革蘭氏染色呈陽性，球形或卵圓形，直徑約0. 5~ 2. 5ym，雙球狀或連珠狀排列；菌落形態(tài)圓形、顏色橙黃色，表面光滑、邊緣齊整?？奢^好利 用葡萄糖、果糖、淀粉等碳源，能夠利用硫酸銨、蛋白胨、水解酪蛋白等氮源；具有氧化酶、 過氧化氫酶活性，明膠液化實(shí)驗(yàn)呈陽性，在含有酪蛋白的低溫平板上（4~20°C)可產(chǎn)生明 顯的透明圈。該菌株已于2013年08月29日保存于中國科學(xué)院微生物研宄所中國微生物 菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為：CGMCCNo. 8088,地址：北京市朝陽區(qū)北 辰西路1號(hào)院3號(hào)。本發(fā)明所涉及的低溫蛋白酶產(chǎn)生菌可以是自然篩選的原始菌株，也可 以是通過自然變異或人工誘導(dǎo)變異的變異本菌株產(chǎn)生的低溫蛋白酶。
[0021] 二、菌株產(chǎn)酶特性說明：本發(fā)明的動(dòng)性球菌TCCC11813可發(fā)酵產(chǎn)生低溫蛋白酶，其 酶學(xué)特征為：最適反應(yīng)溫度在35~37°C之間，并且在25-40°C之間均有較好的催化活性 (最高催化酶活的50%以上），溫度高于50°C，酶活基本喪失，表現(xiàn)出明顯的低溫蛋白酶特 性；酶的熱穩(wěn)定性研宄表明：該菌株所產(chǎn)蛋白酶的熱穩(wěn)定性較低，45°C保溫60min，則酶活 僅剩原來的10%，50°C保溫lmin，則催化活性完全喪失，10°C以下保溫lh，酶活仍保持在 90%以上。該酶在pH4. 0-10.OpH范圍內(nèi)均具有催化活力，其最適作用pH為8.0左右；當(dāng) pH值升至9. 0時(shí)，其酶活約為最高酶活的70%左右，當(dāng)pH值升至10. 0時(shí)，酶活大幅下降， 僅為最高酶活的25%;當(dāng)pH值降至7. 0時(shí)，酶活力約為最高活力的82%。因此該菌株所產(chǎn) 蛋白酶為低溫堿性蛋白酶。金屬離子Ca2+對(duì)該菌株所產(chǎn)蛋白酶有激活作用，Mn2+對(duì)其基本 沒有影響；Mg2+、Ba2+、Fe3+、Zn2+、Co2+、Zn2+則對(duì)其有一定的抑制作用，Ni2+對(duì)其抑制作用最 強(qiáng)，濃度為1.Ommol/L的Ni2+可抑制90%以上的酶活，因此組氨酸可能是該酶的活性中心 之一；EDTA對(duì)該酶有一定抑制作用，某些金屬離子可能對(duì)維持酶分子的三維結(jié)構(gòu)有重要作 用；另外該酶被DEPC、PMSF、EDAC強(qiáng)烈抑制，因此該菌株所產(chǎn)蛋白酶的活性位點(diǎn)應(yīng)包括His、 Ser以及羧基氨基酸。從上述分析結(jié)果推測(cè)，該菌株所產(chǎn)蛋白酶應(yīng)屬于絲氨酸蛋白水解酶， 并且含有典型的由His、Ser以及Asp組成的催化活性中心結(jié)構(gòu)。
[0022] 三、所產(chǎn)低溫蛋白酶基因特性說明：從該動(dòng)性球菌TCCC11813菌株的基因組中獲 得了一種低溫蛋白酶編碼基因，其成熟肽編碼序列、信號(hào)肽編碼序列以及編碼區(qū)上游的部 分表達(dá)調(diào)控序列如序列1所示；序列分析結(jié)果顯示：該基因?yàn)樾滦偷鞍酌妇幋a基因，其編碼 的氨基酸序列與目前數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的蛋白序列相比，最高同源性僅為75%左右?？赏ㄟ^ 分子生物學(xué)技術(shù)從原始菌株中克隆低溫蛋白酶編碼基因，并使其在特定宿主中實(shí)現(xiàn)功能表 達(dá)。
[0023] 16srDNA測(cè)序引物：
[0024] 16SrDNAF:5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'
[0025] 16SrDNAR:5' -GGTTACCTTGTTACGACTT-3'
[0026] 16srDNA測(cè)序結(jié)果：
[0027]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一株低溫蛋白酶生產(chǎn)菌，其特征在于：所述菌株保藏日期為2013年08月29日，保 藏單位為：中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為：CGMCCNo. 8088， 地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，分類命名為：動(dòng)性球菌Planococcussp.。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的低溫蛋白酶生產(chǎn)菌，其特征在于：所述菌株能夠利用葡萄糖、 果糖、淀粉作為碳源，能夠利用硫酸銨、蛋白胨、水解酪蛋白作為氮源；具有氧化酶、過氧化 氫酶活性，明膠液化實(shí)驗(yàn)呈陽性，在含有酪蛋白的4~20°C低溫平板上產(chǎn)生明顯的透明圈。
3. -種低溫蛋白酶基因，其特征在于：其成熟肽編碼序列、信號(hào)肽編碼序列以及編碼 區(qū)上游的部分表達(dá)調(diào)控序列如序列1所示。
4. 一種低溫蛋白酶，其特征在于：由權(quán)利要求1所述的菌株發(fā)酵獲得。
5. -種低溫蛋白酶，其特征在于：經(jīng)由權(quán)利要求3所述的基因表達(dá)獲得。
6. -種產(chǎn)低溫蛋白酶的基因工程，其特征在于：含有權(quán)利要求3所述的低溫蛋白酶基 因。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種低溫蛋白酶生產(chǎn)菌及該菌產(chǎn)生的低溫蛋白酶和該酶的基因，首次從南印度洋深海沉積物中分離到一株產(chǎn)低溫蛋白酶動(dòng)性球菌Planococcus sp.菌種保藏編號(hào)為：CGMCC No.8088，菌株的最適生長(zhǎng)溫度及最佳產(chǎn)酶溫度均為20℃，發(fā)酵水平的蛋白酶產(chǎn)量可達(dá)280U/mL；該菌株所產(chǎn)蛋白酶的最適作用溫度為在30～37℃之間，最適pH為7.5～9.0，30℃條件下可保持最高催化活力的80％以上，而在20～25℃之間仍具有較高的催化活力；該菌株所產(chǎn)蛋白酶屬于典型的低溫堿性蛋白酶，在常溫下具有較好的催化活性，因此在食品加工業(yè)及冷水洗滌劑開發(fā)等方面具有較高的研究?jī)r(jià)值。CGMCC No.808820130829
【IPC分類】C12R1-01, C12N1-20, C12N9-52, C12N15-57
【公開號(hào)】CN104818225
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510105290
【發(fā)明人】張會(huì)圖, 路福平, 莫清珊
【申請(qǐng)人】天津科技大學(xué)
【公開日】2015年8月5日
【申請(qǐng)日】2015年3月10日