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一種間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法及用圖

文檔序號(hào):8496398閱讀:934來源:國知局
一種間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法及用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法及用途。
【背景技術(shù)】
[0002]間充質(zhì)干細(xì)胞是一種具有自我復(fù)制能力和多向分化潛能的成體干細(xì)胞,這種干細(xì)胞能夠發(fā)育成硬骨、軟骨、脂肪和其他類型的細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞可以接受移植,而它們會(huì)成長為何種類型的細(xì)胞取決于其被注入的部位及營養(yǎng)液的種類。1976年,F(xiàn)reidenstein首次發(fā)現(xiàn)在骨髓里存在一群不純一的細(xì)胞群體,這種細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)貼壁生長,形態(tài)和成纖維細(xì)胞相似,呈克隆性增殖,并提出骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的概念。后經(jīng)過深入和廣泛的研宄,發(fā)現(xiàn)存在于人體發(fā)生、發(fā)育過程的許多種組織中。人類對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性、來源、誘導(dǎo)分化、前期臨床應(yīng)用等取得了長足的進(jìn)展。
[0003]目前,尚沒有有效的從皮膚中培養(yǎng)獲得間充質(zhì)干細(xì)胞的報(bào)道,也沒有應(yīng)用該種類的干細(xì)胞進(jìn)行皮膚再生和分化成其他種類的干細(xì)胞的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法。
[0005]本發(fā)明的目的還在于提供上述制備的間充質(zhì)干細(xì)胞在構(gòu)建真皮組織和肺泡中的應(yīng)用。
[0006]一種間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法,按照如下步驟進(jìn)行:
[0007](I)將皮膚的真皮層組織取出,平鋪在平皿上,采用清洗液和消毒液清洗真皮層組織;
[0008](2)向平皿中緩慢加入間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基,放入培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)3-5天加入占間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)量5-10%的營養(yǎng)液,培養(yǎng)至8-10天更換一次間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基和營養(yǎng)液,此后每隔2-4天更換一次間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基和營養(yǎng)液;
[0009](3)當(dāng)平皿內(nèi)的貼壁細(xì)胞融合率達(dá)到60-70%時(shí),使用消化酶使貼壁細(xì)胞脫離平皿底部,離心,去除上清液,加入間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基重新懸浮,再接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)行傳代并擴(kuò)增培養(yǎng),每隔1-2天換充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)一次,至融合率達(dá)到80-95%,得到皮膚間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0010]所述清洗液為PBS,BSS,生理鹽水或者去離子水。
[0011]所述消毒液為雙氧水,70%乙醇水溶液或者酒精。
[0012]所述營養(yǎng)液為肌醇溶液,氨基酸溶液,白細(xì)胞介素,轉(zhuǎn)鐵蛋白溶液,葡萄糖,丙酮酸鈉,乳酸鈉,胎牛血清,干細(xì)胞生長因子中的一種或一種以上。
[0013]上述間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法制備的間充質(zhì)干細(xì)胞在構(gòu)建真皮組織中的應(yīng)用,所述構(gòu)建步驟如下:將培養(yǎng)至三代或三代以上的間充質(zhì)干細(xì)胞消化成單細(xì)胞,按細(xì)胞數(shù)量1:1混合后接種于Matrigel中,使用間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),2天后換用真皮培養(yǎng)基,具體操作為胰酶消化間充質(zhì)干細(xì)胞為單細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù)后用培養(yǎng)基重懸,并與等體積4°C解凍的Matrigel混合,接種于24孔板,置于37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱,20分鐘后,待Matrigel凝固,加入培養(yǎng)基,每孔接種2.5X 15間充質(zhì)干細(xì)胞,與50 μ L Matrigel混合后接種,接種成功后,隔天換液,體外培養(yǎng)I天后,細(xì)胞聚集成圓盤形狀,3天后,可見真皮組織形成,6-10天后真皮組織長到最厚。
[0014]所述真皮培養(yǎng)基的組成成分如下:3-10wt% BSA, 3-10% FBS,胰島素0.1-2%,轉(zhuǎn)鐵蛋白0.1_2%,核黃素0.1-2%,75-90%去離子水。
[0015]上述間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法制備的間充質(zhì)干細(xì)胞在構(gòu)建肺泡中的應(yīng)用,所述構(gòu)建步驟如下:將培養(yǎng)至三代或三代以上的間充質(zhì)干細(xì)胞消化成單細(xì)胞,按細(xì)胞數(shù)量1:1混合后接種于Matrigel中,使用間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),2天后換用肺泡培養(yǎng)基,具體操作為胰酶消化間充質(zhì)干細(xì)胞為單細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù)后用培養(yǎng)基重懸,并與等體積4°C解凍的Matrigel混合,接種于24孔板,置于37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱,20分鐘后,待Matrigel凝固,加入培養(yǎng)基,每孔接種2.5 X 15間充質(zhì)干細(xì)胞,與50 μ L Matrigel混合后接種,接種成功后,隔天換液,體外培養(yǎng)I天后,細(xì)胞聚集成類肺泡形狀,3天后,可見肺泡形成,6-10天后肺泡長到最大。
[0016]所述真皮培養(yǎng)基的組成成分如下:3-10wt% BSA,3-10% FBS,堿性成纖維因子0.1-2%,白細(xì)胞介素-80.1_2%,桂皮鞣質(zhì)D10.1-2%,75-90%去離子水。
[0017]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明的方法從真皮層分離并成功培養(yǎng)了間充質(zhì)干細(xì)胞,該方法簡單,效率高,制備的間充質(zhì)干細(xì)胞具有分化為真皮組織及類肺泡器官的功能,為將來實(shí)現(xiàn)皮膚移植和肺泡器官移植打下了良好的基礎(chǔ)。
【具體實(shí)施方式】
[0018]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
[0019]實(shí)施例1
[0020]一種間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法,按照如下步驟進(jìn)行:
[0021](I)將皮膚的真皮層組織取出,平鋪在平皿上,采用PBS和酒精清洗真皮層組織;
[0022](2)向平皿中緩慢加入間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基,放入培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)3-5天加入占間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)量5-10%的轉(zhuǎn)鐵蛋白溶液,培養(yǎng)至8-10天更換一次間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)鐵蛋白溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2% ),此后每隔2-4天更換一次間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)鐵蛋白溶液;
[0023](3)當(dāng)平皿內(nèi)的貼壁細(xì)胞融合率達(dá)到60-70%時(shí),使用消化酶使貼壁細(xì)胞脫離平皿底部,離心,去除上清液,加入間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基重新懸浮,再接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)行傳代并擴(kuò)增培養(yǎng),每隔1-2天換充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)一次,至融合率達(dá)到80-95%,得到皮膚間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0024]從真皮層組織處理到得到皮膚間充質(zhì)干細(xì)胞,整個(gè)周期為40天。
[0025]實(shí)施例2
[0026]一種間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法,按照如下步驟進(jìn)行:
[0027](I)將皮膚的真皮層組織取出,平鋪在平皿上,采用BSS和去離子水清洗真皮層組織;
[0028](2)向平皿中緩慢加入間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基,放入培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)3-5天加入占間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)量5-10%的肌醇溶液,培養(yǎng)至8-10天更換一次間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基和肌醇溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為I % ),此后每隔2-4天更換一次間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基和肌醇溶液;
[0029](3)當(dāng)平皿內(nèi)的貼壁細(xì)胞融合率達(dá)到60-70%時(shí),使用消化酶使貼壁細(xì)胞脫離平皿底部,離心,去除上清液,加入間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基重新懸浮,再接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)行傳代并擴(kuò)增培養(yǎng),每隔1-2天換充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)一次,至融合率達(dá)到80-95%,得到皮膚間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0030]從真皮層組織處理到得到皮膚間充質(zhì)干細(xì)胞,整個(gè)周期為40天。
[0031]實(shí)施例3
[0032]一種間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法,按照如下步驟進(jìn)行:
[0033](I)將皮膚的真皮層組織取出,平鋪在平皿上,采用PBS和酒精清洗真皮層組織;
[0034](2)向平皿中緩慢加入間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基,放入培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)3-5天加入占間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)量5-10%的丙酮酸鈉溶液,培養(yǎng)至8-10天更換一次間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基和丙酮酸鈉溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5% ),此后每隔2-4天更換一次間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基和丙酮酸鈉溶液;
[0035](3)當(dāng)平皿內(nèi)的貼壁細(xì)胞融合率達(dá)到60-70%時(shí),使用消化酶使貼壁細(xì)胞脫離平皿底部,離心,去除上清液,加入間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基重新懸浮,再接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)行傳代并擴(kuò)增培養(yǎng),每隔1-2天換充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)一次,至融合率達(dá)到80-95%,得到皮膚間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0036]從真皮層組織處理到得到皮膚間充質(zhì)干細(xì)胞,整個(gè)周期為40天。
[0037]實(shí)施例4
[0038]一種間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法,按照如下步驟進(jìn)行:
[0039](I)將皮膚的真皮層組織取出,平鋪在平皿上,采用PBS和酒精清洗真皮層組織;
[0040](2)向平皿中緩慢加入間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基,放入培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)3-5天加入占間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)量5-10%的營養(yǎng)液,培養(yǎng)至8-10天更換一次間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基和營養(yǎng)液,此后每隔2-4天更換一次間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基和營養(yǎng)液;
[0041]所述營養(yǎng)液包含如下質(zhì)量分?jǐn)?shù)的組分:肌醇0.3%,白細(xì)胞介素0.15%,轉(zhuǎn)鐵蛋白0.4%,葡萄糖1.5%,丙酮酸鈉0.6 %,乳酸鈉0.6 %,干細(xì)胞生長因子0.15 %,余量為去離子水。
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