能夠特異性結(jié)合胃癌細(xì)胞中的ts/mdep蛋白的適配子的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本項(xiàng)發(fā)明屬生物檢測領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 核酸適配子（aptamer)是一種生物大分子的人工單鏈寡核苷酸配體，通過 SELEX(SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment)技術(shù)從隨機(jī)單 鏈寡核苷酸文庫中篩選獲得。SELEX技術(shù)（即系統(tǒng)進(jìn)化指數(shù)富集技術(shù))是20世紀(jì)90年代初 研制/發(fā)展起來的一種新的組合化學(xué)技術(shù)，其運(yùn)用大容量的隨機(jī)寡核苷酸文庫，結(jié)合體外 PCR擴(kuò)增技術(shù)，以指數(shù)富集與靶分子特異結(jié)合的寡核苷酸，經(jīng)過多輪篩選，獲得親和力高、特 異性強(qiáng)的核苷酸適配子（aptamers)。該技術(shù)己成功運(yùn)用于許多祀分子的篩選，包括金屬離 子、有機(jī)染料、藥物、蛋白質(zhì)、氨基酸以及各種細(xì)胞因子等。這種方法具有簡便、快速、經(jīng)濟(jì) 等特點(diǎn)，與其他組合化學(xué)庫如隨機(jī)膚/肽庫、抗體庫和噬菌體表面展示文庫相比，從寡核苷 酸文庫中篩選出的適配子具許多優(yōu)勢：a.本身是寡核苷酸，分子量較小，可以化學(xué)合成，節(jié) 約成本。b.具有比抗體更高的親和性和特異性。c.便于標(biāo)記，可以在不同部位有選擇性的 標(biāo)記。d.重復(fù)性好，穩(wěn)定性好，易于保存，對高溫和劇烈條件不敏感。因此，寡核苷酸適配 子/SELEX技術(shù)具有良好的應(yīng)用前景，特別是在抗體工程領(lǐng)域。消減SELEX技術(shù)是識別癌與 非癌細(xì)胞間微小差異、篩選癌細(xì)胞特異性親和適配子的有力工具。
[0003] 核酸適配子篩選的基本步驟如下：設(shè)計(jì)并合成隨機(jī)單鏈寡核苷酸文庫；將文庫與 靶標(biāo)共孵育，使文庫中能與靶標(biāo)特異性結(jié)合的寡核酸與靶標(biāo)形成復(fù)合物，分離復(fù)合物并洗 脫寡核酸，以洗脫的寡核酸為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，制備成新的單鏈隨機(jī)寡核苷酸文庫，開始 下一輪篩選；重復(fù)數(shù)輪孵育-洗脫-擴(kuò)增，與靶標(biāo)高特異性和高親和力結(jié)合的核酸序列將 從文庫中篩選出來并被指數(shù)富集；對最后一輪篩選后制備的文庫進(jìn)行克隆、測序，其中長度 及兩端序列與文庫相符者即為核酸適配子；測定各核酸適配子與靶標(biāo)結(jié)合的特異性和親和 力，選出能高特異性和高親和力結(jié)合靶標(biāo)者，即可應(yīng)用于靶標(biāo)的檢測分析。
[0004] 世界上與腫瘤相關(guān)的疾病中，胃癌占第二位，并且是亞洲人群中最常見的惡性腫 瘤，嚴(yán)重的危害著人類的健康。人們期望能闡明胃癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，從而有效的預(yù)防和 治療這一惡性腫瘤。盡管大量的研宄證實(shí)胃癌的發(fā)生與多種因素有關(guān)包括寸大食、環(huán)境以 及細(xì)菌或病毒感染，如幽門螺旋桿菌的感染，近年來分子機(jī)制研宄發(fā)現(xiàn)眾多基因參與胃癌 的發(fā)生發(fā)展，如E-cadherin表達(dá)的缺失、p53基因、TGF-0、c-met、erbB-2和RUNX3等，這 些研宄解釋了胃癌部分發(fā)病機(jī)制，對于胃癌的詳細(xì)的分子發(fā)病機(jī)制我們還知之甚少。
[0005] 與正常細(xì)胞相比，肺瘤細(xì)胞的最根本的特征之一就是細(xì)胞周期調(diào)控異常，正常細(xì) 胞向惡性細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中，多基因變異積累賦予了腫瘤細(xì)胞特有的功能，如腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生 許多自身的生長因子，對于抑止細(xì)胞生長的信號不敏感，逃避凋亡，具有無限的復(fù)制潛能， 均能歸結(jié)到變異的基因?qū)е录?xì)胞周期調(diào)控異常，特別是細(xì)胞周期checkpoint異常，從而賦 予腫瘤細(xì)胞失控性生長的特性?，F(xiàn)有技術(shù)中，比如CN101168566A公開了TS/MEDP蛋白在M 期的BGC823中表達(dá)最高，隨著細(xì)胞分裂的完成，其表達(dá)量逐漸降低。更重要的是在配對的 胃癌組織中表達(dá)，而正常胃粘膜中未見表達(dá)，還證實(shí)TS/MEDP基因在多種細(xì)胞增殖旺盛的 胚胎組織中表達(dá)，因此TS/MEDP基因在組織中具有如下表達(dá)特征：TS/MDEP在細(xì)胞增值旺 盛的胚胎組織高表達(dá)，成年后組織細(xì)胞中此基因被關(guān)閉，在腫瘤細(xì)胞中又出現(xiàn)高表達(dá)，符 合癌基因的表達(dá)規(guī)律。因此，鑒定該蛋白的表達(dá)量的多少，對于預(yù)測胃癌具有較高的利用價(jià) 值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種DNA適配子，能夠特異性結(jié)合胃癌細(xì)胞中的TS/MDEP蛋 白，可以來實(shí)現(xiàn)胃癌治療藥物運(yùn)送的靶向性，可用于胃癌的診斷與治療。
[0007] 本發(fā)明采用以下技術(shù)方案： 體外合成一個(gè)含有38個(gè)隨機(jī)序列的單鏈DNA文庫，通過體外轉(zhuǎn)錄構(gòu)建出單鏈RNA適 配子隨機(jī)文庫；采用酵母表達(dá)的方法體外表達(dá)丁型肝炎病毒表面蛋白，以其為靶蛋白，采 用SELEX技術(shù)篩選具有高親和力的表面抗原特異性RNA適配子；通過結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件RNA StructureProgram分析預(yù)測適配子的二級結(jié)構(gòu)；通過膜結(jié)合測定實(shí)驗(yàn)、凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)鑒定 篩選適配子對靶蛋白的特異性和親和力，得到了多個(gè)與表面抗原親和力高、特異性強(qiáng)的適 配子。所述的適配子都能形成各自的特異莖環(huán)結(jié)構(gòu)。所述適配子能特異性、高親和力地結(jié) 合胃癌TS/MDEP蛋白。所述適配子序列如下： TS-002：CTCTCCTTAGACTATTACAATCTATTCATATGTTACAA TS-005:GGTAACTAGCGTTACTGCTAGCTCTCCTTAGACTATTACAATCTATTCATATGTTACAATGCATAA GGCATCATTGGAA TS-006:GGTAACTAGCGTTACTGCTAGATGACACATTAACCCTCCCTATCTCAAACAATTTCAAATGCATAA GGCATCATTGGAA TS-013:GGTAACTAGCGTTACTGCTAGCTTCTCAATACAATATTCAAATTTCTATAACACTATCATGCATAA GGCATCATTGGAA TS-014:GGTAACTAGCGTTACTGCTAGTCAATTCGCAAATTAACCTCCGCTCACACTACACCCACTGCATAA GGCATCATTGGAA TS-015:GGTAACTAGCGTTACTGCTAGCCGCACCTTATTAACACAACCTACCTTATTTCCTACACTGCATAA GGCATCATTGGAA TS-017:GGTAACTAGCGTTACTGCTAGACATTACATAATACATTCATCCGCCAACACACCAACACTGCATAA GGCATCATTGGAA TS-019:GGTAACTAGCGTTACTGCTAGACACCAACCACTCACTCTTCCTATTGTTTCACATATTCTGCATAA GGCATCATTGGAA TS-024:GGTAACTAGCGTTACTGCTAGCTCTCCACATACCTTTTTATCAAGAATATATAACAACCTGCATAA GGCATCATTGGAA TS-026:GGTAACTAGCGTTACTGCTAGATATAAGAATACCCAACACCTCCTCTCCACTCCTAAATTGCATAA GGCATCATTGGAA TS-028:GGTAACTAGCGTTACTGCTAGCTCCTAGAATACAATCGCTCAAACTCTACCTAAAGATATGCATAA GGCATCATTGGAA TS-030:GGTAACTAGCGTTACTGCTAGTAGATCATACAATATCATTATTCCGCCTACATTCCAATTGCATAA GGCATCATTGGAA 本發(fā)明的有益效果：（1)獲得了一種能夠特異高效結(jié)合胃癌細(xì)胞中TS/MDEP蛋白的適 配子。該適配子可以大量人工制備，方法簡單，成本低廉。（2)以核酸適配子為基礎(chǔ)可以制 備成為靶向胃癌細(xì)胞的診斷和治療藥物。
【具體實(shí)施方式】
[0008] 實(shí)施例ITS/MDEP蛋白特異性結(jié)合DNA適配子的SELEX篩選 采用本領(lǐng)域常規(guī)的TS/MDEP蛋白表達(dá)的方法。根據(jù)已知的基因序列，通過常規(guī)基因合 成或者基因組調(diào)取的方式來獲得相應(yīng)的基因序列，采用酵母表達(dá)的方法體外表達(dá)TS/MDEP 蛋白，獲得了相應(yīng)的蛋白，命名為TS/MDEP。
[0009] 化學(xué)合成初始寡核苷酸隨機(jī)文庫及引物，序列如下：（5'-GGTAACTAGCGTTACTGCTA G--N38--TGCATAAGGCATCAITGGAA-3')，其中N38為38個(gè)隨機(jī)寡核苷酸； 引物PI:GGTAACTAGCGTTACTGCTAG; 引物P2 :TTCCAATGATGCCTTATGCA。
[0010] 將單鏈DNA文庫擴(kuò)增為雙鏈DNA，產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳并切膠回收純化；以 回收的雙鏈DNA為模板，體外轉(zhuǎn)錄出單鏈RNA隨機(jī)文庫，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)PAGE純化。70ygRNA 文庫經(jīng)硝酸纖維素膜反篩去除與膜結(jié)合的RNA分子，然后與2ugHiAg37°C孵育30min， 反應(yīng)液經(jīng)硝酸纖維素膜濾過，洗滌濾膜；然后將濾膜剪碎，置于洗脫緩沖液（6mol/L尿素， 0? 6mol/L醋酸按，1.5mmol/LEDTA，0. 15%SDS)中煮沸4min，離心，取上清，無水乙醇沉 淀RNA，并重新溶解于20y1DEPC水中；以RNA為模板RT-PCR擴(kuò)增雙鏈DNA，體外轉(zhuǎn)錄 出RNA文庫用于下一輪篩選；每輪篩選過程中RT-PCR得到雙鏈DNA文庫，以該雙鏈DNA為 模板體外轉(zhuǎn)錄出RNA適配子庫，篩選共進(jìn)行10輪。
[0011] 實(shí)施例2特異性高親和力的TS/MDEP結(jié)合適配子的獲得 將RNA適配子分別取1.5yg，用牛小腸堿性磷酸酶（CIP) 37°C消化lh，純化回 收去磷酸化的RNA;通過T4多核苷酸激酶標(biāo)記[y-32P]ATP于去磷酸化的RNA分子末 端。lOnmol放射性標(biāo)記的RNA適配子分別與不同濃度（l-200nM)的TS/MDEP37°C孵育 30min，各組反應(yīng)液經(jīng)硝酸纖維素膜濾過，洗滌濾膜，干燥濾膜，液閃計(jì)數(shù)儀測定濾膜上殘留 的放射量，同一樣品平行做兩次測定。計(jì)算各個(gè)適配子與TS/MDEP的解離常數(shù)。結(jié)果如下：
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種識別TS/MDEP蛋白寡核苷酸序列，其特征在于為包括SEQIDNo. 1-12任一條序 列所示，或者在該序列的基礎(chǔ)上進(jìn)行的一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的替換，并保留其活性。
2. 權(quán)利要求1所示的寡核苷酸序列在檢測胃癌中的應(yīng)用。
3. 權(quán)利要求1所示的寡核苷酸序列用于制備識別TS/MDEP蛋白的試劑盒應(yīng)用。
4. 權(quán)利要求1所示的寡核苷酸序列用于制備檢測胃癌的試劑盒應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種靶向人TS/MDEP蛋白的核酸適配子及其序列。本發(fā)明應(yīng)用新的組合化學(xué)技術(shù)SELEX，以TS/MDEP蛋白為靶蛋白，從單鏈RNA隨機(jī)文庫中篩選出了能與TS/MDEP蛋白特異性結(jié)合的DNA適配子。所述適配子在其隨機(jī)序列區(qū)域能形成特殊的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，能特異性、高親和力地結(jié)合TS/MDEP蛋白或靶向結(jié)合至胃癌細(xì)胞。該RNA適配子為胃癌診療領(lǐng)域提供了一種特異高效的標(biāo)記分子，并為開發(fā)胃癌診斷試劑與治療藥物提供了新的選擇。
【IPC分類】C12N15-115, G01N33-68
【公開號】CN104818278
【申請?zhí)枴緾N201510183245
【發(fā)明人】劉紅衛(wèi)
【申請人】劉紅衛(wèi)
【公開日】2015年8月5日
【申請日】2015年4月17日