一種豬Lgr5基因及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及家畜分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種豬Lgr5基因及其應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] Lgr5,又名GPR49，HG38，F(xiàn)EX，是G-蛋白偶聯(lián)受體超家族成員，是由具有18個富含 亮氨酸的重復(fù)單位和7個跨膜區(qū)域組成的大分子蛋白；最新研究證明，Lgr5是Wnt信號通 路下游的靶向基因，并可作為腸等部位的干細胞標(biāo)記物，Lgr5表達的產(chǎn)物在胚胎和器官的 發(fā)育以及多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中均發(fā)揮著重要作用。
[0003] Lgr5基因位于人12號染色體12q22_q23,小鼠10號染色體D2| 10,大鼠（Rattus norvegicus)7號染色體 7q22,恒河稱猴（Macaca mulatta)11 號染色體，牛（Bos taurus) 5號染色體，家雞（Gallus gallus)l號染色體，家豬（Sus Scrofa)5號染色體上；目前國內(nèi) 外關(guān)于豬Lgr5基因的研究很少。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)中沒有豬Lgr5全基因序列的缺陷， 提供一種Lgr5基因。
[0005] 本發(fā)明的第二個目的是提供上述Lgr5基因編碼的蛋白。
[0006] 本發(fā)明的第三個目的是提供含有上述Lgr5基因的載體或/和重組體。
[0007] 本發(fā)明的第四個目的是提供上述基因或/和基因編碼的蛋白的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)的： 一種豬Lgr5基因，其基因序列如SEQIDN0 :1所示。
[0009] 現(xiàn)有技術(shù)中還沒有克隆出豬的Lgr5基因，發(fā)明人在人Lgr5基因和鼠Lgr5基因的 基礎(chǔ)上，通過分子生物學(xué)的手段克隆出Lgr5基因，在克隆Lgr5基因的過程中，通常是選取 人Lgr5基因和鼠Lgr5基因同源的片段進行RACE，從而進一步克隆出Lgr5基因，但是，發(fā)明 人通過設(shè)計同源引物的方法無法克隆出Lgr5基因，發(fā)明人設(shè)計了特異性的引物才克隆出 了Lgr5基因。
[0010] 本發(fā)明所述能夠擴增Lgr5基因的引物序列如SEQIDN0 :3~13所示。
[0011] 本發(fā)明還提供編碼豬Lgr5基因的蛋白，其氣基酸序列如SEQIDN0 :2所不。
[0012] 本發(fā)明還提供了一種用于檢測豬Lgr5基因的引物，所述引物序列如SEQIDN0: 14~15所示。
[0013] 含有Lgr5基因的載體或含有所述載體的重組體也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0014] 本發(fā)明還提供Lgr5基因和/或Lgr5基因編碼的蛋白在制備促進細胞增殖的制劑 中的應(yīng)用，具體地，所述細胞為豬的小腸上皮細胞。
[0015] 本發(fā)明還提供Lgr5基因和/或Lgr5基因編碼的蛋白在制備加快細胞損傷修復(fù)的 制劑中的應(yīng)用，具體地，所述細胞為豬的小腸上皮細胞。
[0016] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果： 本發(fā)明提供了一種豬Lgr5基因，所述基因的序列如SEQIDN0 :1所示，本發(fā)明利用人Lgr5基因和小鼠Lgr5基因為參照序列，設(shè)計特異性引物，運用RACE、普通PCR、重疊PCR的 方法首次克隆出豬Lgr5cDNA;后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)過表達Lgr5基因能夠促進細胞增殖，加快損 傷的細胞修復(fù)，本發(fā)明所述Lgr5為后續(xù)豬Lgr5基因的功能研究和小腸干細胞的研究奠定 了重要基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0017] 圖1為Lgr5基因片段的3'RACE擴增產(chǎn)物的電泳結(jié)果圖；圖中M:DNAMarker DL2000,1 :3'RACE產(chǎn)物。
[0018] 圖2為Lgr5基因片段的PCR擴增產(chǎn)物的電泳結(jié)果圖；圖中M:DNAMarkerDL2000， 1:Lgr5A(1143bp)。
[0019] 圖3為Lgr5基因片段的PCR擴增產(chǎn)物的電泳結(jié)果圖；圖中M:DNAMarkerDL2000， 1:Lgr5B(1727bp)。
[0020] 圖4為Lgr5基因片段的重疊PCR擴增產(chǎn)物的電泳結(jié)果圖；圖中M:DNAMarker DL2000，1 :Lgr5 0RF(2740bp)。
[0021] 圖5為對比例1所述同源引物PCR擴增產(chǎn)物的電泳結(jié)果圖；圖中M:DNAMarker DL2000,1 :Lgr5-a和Lgr5-X引物擴增產(chǎn)物，2 :Lgr5-b和Lgr5-X引物擴增產(chǎn)物。
[0022] 圖6為轉(zhuǎn)染前后Lgr5蛋白相對表達豐度（n=3);其中，1、2、3 :Lgr5過表達組，4、5、 6:對照組(野生型IPEC-1細胞)。
[0023] 圖7為對照組和Lgr5過表達組對細胞增殖能力的影響（n=6)。
[0024]圖8為對照組和Lgr5過表達組對細胞遷移能力的比較（100X，n=3);對照組和 Lgr5過表達組細胞劃痕試驗，其中，A:對照組細胞，0h拍攝；B:Lgr5過表達組細胞，0h拍 攝；C:對照組細胞，6h拍攝；D:Lgr5過表達組細胞，6h拍攝；E:對照組細胞，12h拍攝；F: Lgr5過表達組細胞，12h拍攝；G:對照組細胞，24h拍攝；H:Lgr5過表達組細胞，24h拍 攝。
[0025] 圖9為RT22引物鑒定豬十二指腸、空腸、回腸是否表達Lgr5的PCR擴增產(chǎn)物的電 泳結(jié)果圖；圖中M:DNAMarkerDL2000，1:回腸，2:空腸，3:十二指腸。
[0026] 圖10為RT22引物鑒定IPEC-J2細胞系是否表達Lgr5的PCR擴增產(chǎn)物的電泳結(jié) 果圖；圖中M:DNAMarkerDL2000,1 :IPEC-J2 細胞。
[0027] 圖11為RT22引物的測序圖。
[0028] 圖12為RT22引物的測序圖。
【具體實施方式】
[0029] 下面結(jié)合說明書附圖和具體實施例進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本 發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的簡單 修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍；若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù) 人員所熟知的常規(guī)手段。
[0030] 實施例1Lgr5cDNA序列的合成 1、 引物設(shè)計 根據(jù)人Lgr5基因序列（登陸號為匪_003667. 3)和小鼠Lgr5基因序列（登錄號 為匪_010195. 2)同源性，運用PrimerPremier5軟件設(shè)計了 3'RACE引物如表1 所示。
[0031] 表1 3'RACE弓丨物名稱和序列
【主權(quán)項】
1. 一種豬Lgr5基因，其特征在于，基因序列如SEQIDNO:1所示。
2. 編碼豬Lgr5基因的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。
3. 用于擴增權(quán)利要求1所述基因的引物，其特征在于，所述引物序列如SEQIDNO: 3~13所示。
4. 一種用于檢測權(quán)利要求1所述豬Lgr5基因的引物，其特征在于，引物序列如SEQID NO: 14~15所示。
5. 含有權(quán)利要求1所述基因的載體。
6. 含有權(quán)利要求5所述載體的重組體。
7. 權(quán)利要求1所述基因或權(quán)利要求2所述蛋白在制備促進細胞增殖的制劑中的應(yīng)用。
8. 權(quán)利要求1所述基因或權(quán)利要求2所述蛋白在制備加快細胞損傷修復(fù)的制劑中的 應(yīng)用。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述細胞為豬小腸上皮細胞。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述細胞為豬小腸上皮細胞。
【專利摘要】本發(fā)明屬于家畜分子分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體公開了一種豬Lgr5基因及其應(yīng)用，所述基因的序列如SEQ ID NO：1所示，本發(fā)明利用人Lgr5基因和小鼠Lgr5基因為參照序列，設(shè)計特異性引物，運用RACE、普通PCR、重疊PCR的方法首次克隆出豬Lgr5 cDNA；后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)過表達Lgr5基因能夠促進細胞增殖，加快損傷的細胞修復(fù)，本發(fā)明所述Lgr5為后續(xù)豬Lgr5基因的功能研究和小腸干細胞的研究奠定了重要基礎(chǔ)。
【IPC分類】C12N15-12, C12N15-11, C12Q1-68, C07K14-72
【公開號】CN104818281
【申請?zhí)枴緾N201510082658
【發(fā)明人】王修啟, 嚴會超, 高春起, 陳榮強, 李長茂
【申請人】華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年8月5日
【申請日】2015年2月16日