一種在植物中快速表達外源蛋白的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的說是一種在植物中快速表達外源蛋白的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]近幾十年中，大量研究表明植物生物反應(yīng)器能夠有效表達許多外源蛋白，包括人的血清蛋白，生長因子，抗體，疫苗等。目前，國外利用植物生產(chǎn)的藥用蛋白已經(jīng)用于臨床實踐階段，植物生物反應(yīng)器越來越顯出其重要地位。植物生物反應(yīng)器主要有兩種表達體系，即穩(wěn)定表達體系和瞬時表達體系。植物瞬時表達體系因具有快速，安全，有效等優(yōu)點而越來越受到人們的青睞，也逐漸成為國內(nèi)的研究熱點之一，其實用價值和開發(fā)前景已獲得普遍的冃疋?
[0003]植物瞬時表達體系是以植物病毒載體為介導(dǎo)的，通過葉片注射法將攜帶病毒載體和外源基因的農(nóng)桿菌重懸液注射到植物葉片，并實現(xiàn)植物中外源蛋白的表達。常用的侵染方法如葉片注射法和真空侵染法，葉片注射法需要逐片葉進行注射，其缺點是人工操作較為繁瑣，費時費力，不適合大量植物的侵染，從而影響了其在外源蛋白生產(chǎn)上的進一步推廣及應(yīng)用。
[0004]利用植物作為生物反應(yīng)器來表達外源蛋白是一種常用的方法。其中，植物瞬時表達體系具有潛在的應(yīng)用價值和廣泛的開發(fā)前景。其主要的侵染方法為葉片注射法和真空侵染法，但是，這兩種方法都不適用于大量植物的侵染和外源蛋白的規(guī)模化生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是要提供一種在植物中快速表達外源蛋白的方法，該方法是以植物病毒載體為介導(dǎo)，利用高壓噴槍系統(tǒng)(型號HP-G6)將攜帶有病毒載體的農(nóng)桿菌重懸液侵染植物煙草葉片，通過攜帶外源基因的病毒載體在植物體內(nèi)的大量復(fù)制來表達外源蛋白，該方法簡單的操作過程，較強的實用性，適合外源蛋白的快速表達和規(guī)?；a(chǎn)。
[0006]本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的，該方法包括以下步驟:
[0007]①、植物材料的準備:
[0008]植物材料為煙草，將煙草(Nb)的種子播種于1/2MS培養(yǎng)(現(xiàn)有技術(shù))基中，放于光照培養(yǎng)箱，培養(yǎng)7-8天就可以長出煙草小苗，將煙草小苗移栽于花盆中，在25±3°C的溫度條件下，每天光照16h和黑暗8h的循環(huán)條件下培養(yǎng)18-20天，此時的煙草小苗的苗齡在四葉期一六葉期，作為植物材料備用；上述步驟中對植物材料侵染時期進行了優(yōu)化，即分別選擇苗齡為四葉期，五葉期和六葉期的煙草小苗，每個時期選擇20株煙草小苗作為植物材料。
[0009]②、病毒載體的構(gòu)建:
[0010]先將要表達的外源基因GFP連接在病毒載體p35S-30B上，再將質(zhì)粒p35S-30B-GFP轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，28°C條件下過夜培養(yǎng)，即可獲得攜帶病毒載體和外源基因GFP的農(nóng)桿菌 EHA105-p35S-30B-GFP 的單菌落。
[0011]③、農(nóng)桿菌重懸液的制備:
[0012]挑取上述步驟②中培養(yǎng)的單菌落EHA105-p35S-30B-GFP放入5ml LB培養(yǎng)基中，5ml LB培養(yǎng)基中添加濃度為50mg/ml的卡那霉素5ul、50mg/ml的利福平5ul,然后放入培養(yǎng)箱進行過夜培養(yǎng)16h，培養(yǎng)箱的轉(zhuǎn)速設(shè)置為200r/min，培養(yǎng)溫度為28°C，培養(yǎng)后即可獲得農(nóng)桿菌菌液，然后將Iml的農(nóng)桿菌菌液放入50ml LB培養(yǎng)基中，50ml LB培養(yǎng)基中加濃度為50mg/ml的卡那霉素50ul、50mg/ml的利福平50ul,再添加濃度為lmol/L的苯磺酸Mes (PH5.6)500ul、濃度為lmol/L的乙酰丁香酮ASlOul，再將上述農(nóng)桿菌菌液放入培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，培養(yǎng)箱的轉(zhuǎn)速設(shè)置為200r/min，培養(yǎng)溫度為28°C，過夜培養(yǎng)16_18h，將過夜培養(yǎng)的菌液在3000r/min，4°C條件下離心20min來收集菌體，然后將菌體重懸于MMA (1mmol/L Mgcl2, 1mmoI/L Mes, 10umoI/L AS)，獲得菌液重懸液；上述步驟中對農(nóng)桿菌重懸液進行了優(yōu)化，分別配制濃度(OD6J為0.6，0.8，1.0，1.2，1.4和1.6的菌液重懸液，將菌液重懸液在侵染前放在暗室靜置2-3h后備用。
[0013]④、利用高壓噴槍系統(tǒng)侵染植物:
[0014]將步驟③中準備好的菌液重懸液和金剛砂按照3:1的比例混合，然后放入與高壓噴槍(東莞市安信五金科技有限公司生產(chǎn)，型號R-21S)相連的溶液管中，壓力保持在0.1Mpa，高壓噴槍的噴頭距離葉面15-20cm，將菌液重懸液垂直噴射在步驟①中制備的煙草苗的葉片上，注意噴灑時噴槍不要距離植物材料太近，以免對植物葉片造成較大的傷害，所述金剛砂借助高壓噴槍的壓力在葉片上形成微小的傷口，使菌液重懸液攜帶的病毒載體和外源基因容易侵染植物的葉片，以保證較高的病毒侵染效率和外源基因的表達效率。
[0015]⑤、侵染后植物材料的培養(yǎng)與觀測:
[0016]將上述步驟④中高壓噴槍侵染的植物材料放入光照培養(yǎng)箱(28°C;16h日光燈光照/8h黑暗)進行培養(yǎng)，黑室中，在紫外燈(UV)照射條件下進行觀察，GFP表達的葉片表型為呈現(xiàn)綠色，未表達GFP的葉片呈現(xiàn)紅色；上述步驟中對侵染后植物材料的培養(yǎng)溫度進行了優(yōu)化，在光照培養(yǎng)箱分別選擇不同的培養(yǎng)溫度22°C，25°C ,28°C, 31°C和34°C進行植物材料的侵染后培養(yǎng)，觀察GFP的表達并計算GFP的表達效率表達GFP的煙草植株占總侵染株數(shù)的百分比。
[0017]⑥、GFP的快速表達及檢測
[0018]用Trizol試劑(購于TAKARA公司)提取表達GFP的植株的總RNA，在RNA水平上進行GFP表達的RT-PCR檢測(現(xiàn)有技術(shù))；利用PBS提取液提取植物總可溶性蛋白，進行GFP表達的Western Blotting檢測(現(xiàn)有技術(shù))。
[0019]本發(fā)明具有以下優(yōu)點和積極效果:
[0020]1、本發(fā)明為植物中簡便、快速表達外源蛋白的一種新方法，利用該方法成功表達了綠色熒光蛋白GFP。在大量優(yōu)化實驗中，申請人對影響基因表達的各種因素進行了較為全面具體的研究，確定該方法最適侵染條件，包括菌液重懸液(MMA OD600)濃度，適合該方法的植物材料及侵染時期，植物材料培養(yǎng)的溫度條件等。
[0021]2、本發(fā)明以來源于TMV病毒的載體p35S-30B為媒介，將外源基因連接于病毒載體，通過病毒在植物中的傳播而獲得大量目的蛋白，本發(fā)明目的植物為煙草，目的蛋白為綠色熒光蛋白(GFP)，本發(fā)明首次利用高壓噴槍系統(tǒng)將攜帶有病毒載體和目的基因的農(nóng)桿菌菌液侵染植物并在植物中快速表達外源基因，通過病毒在植物體內(nèi)的快速擴增而在短期內(nèi)獲得大量外源蛋白。
[0022]3、本發(fā)明方法的主要優(yōu)點為操作過程簡單，快捷，易于推廣應(yīng)用，只要將農(nóng)桿菌重懸液和金剛砂按照3:1的比例混合好后，通過高壓噴槍系統(tǒng)噴射在植物葉片上，即可達到將農(nóng)桿菌重懸液侵染植物的目的。
[0023]4、本發(fā)明方法成本低，具有實用價值；操作過程簡單快捷，省時省力，方便有效，能夠?qū)崿F(xiàn)大量植物的侵染工作，能夠應(yīng)用于外源蛋白(如血清蛋白、生長因子、抗體、疫苗等藥用蛋白)的快速、大量表達和規(guī)?；a(chǎn)。
【附圖說明】
[0024]圖1是本發(fā)明p35S-30B-GFP表達載體載體圖。
[0025]圖2是本發(fā)明農(nóng)桿菌重懸液的濃度對蛋白GFP表達效率的影響柱形圖。
[0026]圖3是本發(fā)明煙草小苗的苗齡對蛋白GFP表達效率的影響柱形圖。
[0027]圖4是本發(fā)明侵染后煙草的培養(yǎng)溫度對蛋白GFP表達效率的影響柱形圖。
[0028]圖5是本發(fā)明紫外下綠色熒光蛋白GFP的表型觀察照片圖。
[0029]圖6是本發(fā)明綠色熒光蛋白GFP表達的RT-PCR和Western Blot檢測照片圖。
【具體實施方式】
[0030]實例一:
[0031]分別采用不同的菌液濃度，MMA OD600分別為0.6,0.8，1.0, 1.2，1.4時進行侵染。