一種酶法制備甘油磷酸膽堿的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種酶法制備甘油磷酸膽堿的方法。
【背景技術】
[0002]L-α -甘油磷酸膽堿(CAS號28319-77-9)是自然界中天然存在的物質，是由構成生物細胞膜的主要磷脂成分磷脂酰膽堿(PC)去除2個脂肪酸產生的水溶性物質。甘油磷酸膽堿在生物體內廣泛存在，是人的母乳及體液的組分之一。2009年的食品藥品分類修訂中，將甘油磷酸膽堿定義為食品。近年來科學研宄表明L-α-甘油磷酸膽堿還具有重要的醫(yī)藥價值，它能夠改善和提高腦部的認知能力，在青少年的生長發(fā)育和記憶力提高等方面都具有一定的功效，甚至還可以在一定程度上修復早期的阿爾茨海默癥引起的認知能力損傷。目前L-α-甘油磷酸膽堿在醫(yī)藥中主要應用于消化系統(tǒng)藥物和肝病輔助用藥。這些重要的醫(yī)藥和保健價值，使得L-α -甘油磷酸膽堿在醫(yī)藥和保健食品領域有著越來越廣泛的應用，其市場需求也越來越大。
[0003]天然存在的L-α-甘油磷酸膽堿非常少，一般只存在于動物的器官和乳汁中，更多的需求只能通過工業(yè)生產來滿足。近年來研宄表明可通過天然磷脂中的PC為原料，去除分子中的脂肪酸(脫?；?而獲得L-a-GPC。磷脂和甘油磷酸膽堿對熱均不穩(wěn)定，因此，以PC為底物通過水解或醇解反應制備L- a -GPC時需要在相對溫和的條件下進行。有研宄利用四丁基氫氧化銨為催化劑，水解卵磷脂制備L- a -GPC，工藝過程復雜，成本較高，不易實現(xiàn)規(guī)?；a。與化學法相比，生物酶法反應條件溫和，工藝簡單，適合商業(yè)化規(guī)模生產。專利(申請?zhí)?01010248594.X)公開了利用磷脂酶水解卵磷脂制備甘油磷酸膽堿的方法，可以在水相中將磷脂酰膽堿轉化成甘油磷酸膽堿。
[0004]由于磷脂酶A水解磷脂中的脂肪酸時對其具有位置專一性，例如磷脂酶Al專一性地水解PC中Sn-1位脂肪酸，而產生大量的Sn-2溶血磷脂；磷脂酶A2專一性地水解Sn_2位的脂肪酸，產生大量的Sn-1溶血磷脂；繼續(xù)催化溶血磷脂發(fā)生水解時需要先進行一步酰基轉移，才能將剩余的脂肪酸全部水解下來。這就使得GPC的產生速率和PC利用程度非常依賴于反應中間產物溶血磷脂酰膽堿(LPC)?；D移的速率，而研宄表明，在較低的溫度下溶血磷脂中?；D移的速率非常緩慢。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術存在的不足，提供一種酶法制備甘油磷酸膽堿的方法。偏甘油酯脂肪酶是脂肪酶的一種，具有特殊的底物特異性，可以催化甘油二酯(DAG)和單甘油酯(MAG)發(fā)生反應，不能催化甘油三酯(TAG)發(fā)生反應。本研宄經過大量的試驗證實部分偏甘油酯脂肪酶在適宜的反應條件下可以水解或醇解溶血磷脂中的脂肪酸?；?。該方法采用偏甘油酯脂肪酶和磷脂酶聯(lián)合催化磷脂中的磷脂酰膽堿與水或其他羥基供體發(fā)生反應生產制備L-α -甘油磷酸膽堿，反應產物經過分離純化后即可得到L-α -甘油磷酸膽堿。該方法可以顯著提高酶的催化效率、產品的得率和底物的利用率。
[0006]本發(fā)明目的通過以下技術方案實現(xiàn):
[0007]一種酶法制備甘油磷酸膽堿的方法，包括以下步驟:
[0008](I)將含有磷脂酰膽堿的磷脂與羥基供體、磷脂酶、偏甘油酯脂肪酶混合后，進行水解或醇解反應；所述磷脂酶為磷脂酶A和磷脂酶B中的一種或兩種的混合物；
[0009](2)分離反應產物，回收甘油磷酸膽堿。
[0010]所述偏甘油酯脂肪酶為偏甘油酯脂肪酶Lipase SMGl和Lipase G中的一種或兩種的混合。
[0011]所述磷脂酶和偏甘油酯脂肪酶的質量比為0.1:1?1:10 ;所述磷脂酶的質量分數(shù)為0.1?1% O
[0012]步驟(I)所述反應的時間為30?120分鐘，pH為4-8，溫度為10_50°C。所述pH可通過添加已知的緩沖液實現(xiàn)。
[0013]所述反應的時間為45?60分鐘，pH為6_8，溫度為20-50°C。
[0014]所述反應的溫度為30-45 °C。
[0015]所述羥基供體為水或短鏈一元醇。
[0016]所述羥基供體與磷脂酰膽堿的摩爾比不低于2:1。
[0017]所述磷脂酶不包括磷脂酶C和磷脂酶D。
[0018]本發(fā)明所采用的磷脂可以是來源于大豆磷脂、蛋黃磷脂、蝦油磷脂中的一種或一種以上的混合物，也可以是通過酶法或物理、化學法純化后的磷脂混合物。所述酶一起添加至反應體系中，可控制酶催化反應條件(如溫度、PH、攪拌時間和底物摩爾比)，進而優(yōu)化出特定的磷脂底物適用的反應參數(shù)組合。
[0019]本發(fā)明所采用的回收甘油磷酸膽堿的方法可以是溶劑萃取、柱層析，也可以是一種方法以上的綜合使用。
[0020]本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有如下優(yōu)點:
[0021]本發(fā)明涉及磷脂酶和偏甘油酯脂肪酶一起用于酶反應，催化底物中磷脂酰膽堿去除脂肪酸?；苽涓视土姿崮憠A。當采用偏甘油酯脂肪酶與磷脂酶一起使用時磷脂酰膽堿的轉化率、酶反應速率和甘油磷酸膽堿的得率遠高于磷脂酶單獨使用時，其中底物中的磷脂酰膽堿的轉化率可以達到95%以上，反應持續(xù)時間可以少于一個小時。
【具體實施方式】
[0022]以下通過實施例更詳細地介紹本發(fā)明的實施。在所述實施例中，所有百分比均以質量計。本發(fā)明所用偏甘油酯脂肪酶Lipase SMGl為實驗室自制，已被Wang ff-f, Li T1QinX-1j Ning Ζ-χ, Yang B，Wang Y-h.Product1n of lipase SMGland its applicat1n insynthesizing diacylglyecrol[J].Journal of Molecular Catalysi s B:Enzymatic2012 ;77:87-91文獻公開，申請人向社會提供。
[0023]對比實施例1
[0024]取20g的磷脂混合物(PC含量為85 %，LPC的含量為0.7%，GPC的含量為0.1%，由蛋黃磷脂提取制得)，添加500ml的pH為6.5的緩沖液(0.25M檸檬酸-NaOH)，添加0.2g的磷脂酶Lecitase Ultra(諾維信公司產品，具有磷脂酶Al活力)，并將混合物均質I分鐘。將反應混合物在40°C下正常攪拌I小時。然后利用液相色譜分析酶反應產物得到PC的含量為17.2%，LPC的含量為24.7%, GPC的含量為38.6%, GPC的得率為45.4%。
[0025]對比實施