一次性檢測(cè)腸癌多重基因突變的引物、探針、檢測(cè)體系和試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及肺癌多重基因突變的引物、探針、及檢測(cè)試 劑盒和體系。
【背景技術(shù)】
[0002] 大腸癌是在世界范圍內(nèi)發(fā)病率第三的惡性腫瘤，死亡率高居第二，大約每年新增 一百二十萬患者。在中國，所有惡性腫瘤中，大腸癌己經(jīng)一躍成為死亡率高達(dá)第三位的惡性 腫瘤。大腸癌治療是以手術(shù)為主的積極綜合治療，手術(shù)治療可以切除原發(fā)灶，解除腫瘤造成 的梗阻癥狀。手術(shù)后化療近年來發(fā)展迅速，輔以免疫治療、中藥治療、基因靶向治療、特別是 靶向治療越來越多的用于臨床。大腸癌的發(fā)生是多階段、多步驟、涉及到多種癌基因及抑癌 基因激活或失活等復(fù)雜過程形成的?；煏?huì)提高晚期大腸癌的生存期，但一部分患者會(huì)出 現(xiàn)耐藥，一旦晚期大腸癌發(fā)生耐藥的不良事件，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道生存期不會(huì)超過半年。
[0003] 大腸癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)受多基因、多步驟調(diào)控的復(fù)雜過程，是基因突變致癌的 經(jīng)典模式，此過程常與細(xì)胞增殖、凋亡失控有關(guān)，涉及癌基因（主要為Ras基因）、抑癌基因 (主要包括P53基因、APC基因等）、錯(cuò)配修復(fù)基因（MMR基因）以及一些修飾基因（如C0X-2 等）。
[0004]KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF都是EGFR下游的信號(hào)分子，是眾多信號(hào)通路上關(guān)鍵的 激活因子。這些基因的突變常見于多種惡性腫瘤，在大腸癌患者中的突變率分別為20~ 50%、1 ~6%、10 ~30%、8 ~15%。KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF基因突變一般會(huì)使結(jié)直腸 癌患者對(duì)抗EGFR抗體類藥物產(chǎn)生耐藥。因此，對(duì)大腸癌進(jìn)行KRAS/NRAS/PIK3CA/BRAF基 因遺傳變異的檢測(cè)至關(guān)重要，然而目前臨床上大多每次只能檢測(cè)一個(gè)突變或一段基因的突 變，檢測(cè)通量低，耗時(shí)長，尚無能夠同時(shí)、一次性完成對(duì)此4個(gè)基因突變進(jìn)行檢測(cè)的試劑盒。
[0005] 因此以期待找到適合大腸癌靶向治療將提高晚期大腸癌的預(yù)后生存期、減少耐藥 不良事件的發(fā)生，為大腸癌的個(gè)體化治療提供新方案，使晚期大腸癌患者受益?；蛲蛔兊?聯(lián)合檢測(cè)能提高腫瘤臨床治療的針對(duì)性，降低治療費(fèi)用，節(jié)省寶貴的治療時(shí)間
[0006] 本發(fā)明提供一種高靈敏度和高特異性的用于一次性檢測(cè)多重大腸癌突變基因的 引物、探針、試劑盒及引物分配方式。該檢測(cè)試劑盒利用DNA樣本進(jìn)行基因突變的檢測(cè)， 提供突變狀態(tài)的定性評(píng)估，特異性和靈敏度高，檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性好，而且引入了熒光檢測(cè)技 術(shù)，克服了傳統(tǒng)PCR產(chǎn)物遺留污染的問題，操作簡便快捷，可輔助臨床醫(yī)生篩選出可受益于 腫瘤靶向藥物的大腸癌等癌癥患者，為臨床腸癌基因突變的檢測(cè)提供了一種快速可靠的檢 測(cè)方法。該方法可以實(shí)現(xiàn)一次性檢測(cè)DNA的KRAS/NRAS/PIK3CA/BRAF基因37種突變，大大 縮短了檢測(cè)的時(shí)間，為臨床醫(yī)生對(duì)結(jié)直腸癌患者選擇腫瘤靶向藥物治療提供參考。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種用于一次性檢測(cè)多重腸癌突變基因的引物、探針，包 括10^^1^、？11(304、81^等突變基因的引物、探針及分配方式，其序列如表1;
[0008] 表1腸癌突變特異性引物、新型探針及分配方式
【主權(quán)項(xiàng)】
1.用于檢測(cè)腸癌的引物和探針，包括如下61條序列，且所述的序列用12聯(lián)管分裝分組 如下：

2. -種用于檢測(cè)腸癌基因突變檢測(cè)的反應(yīng)體系，包括：
3. -種試劑盒，包括權(quán)利要求1所述的序列。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一次性檢測(cè)腸癌多重突變基因的引物、探針、檢測(cè)體系和試劑盒，其中包括用于檢測(cè)腸癌KRAS、NRAS、PIK3CA和BRAF基因突變的引物、探針及其分配方式。本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒采用12聯(lián)PCR反應(yīng)條設(shè)計(jì)，每一個(gè)12聯(lián)PCR條檢測(cè)一個(gè)樣品，12聯(lián)條的1-11管內(nèi)裝有相應(yīng)的KRAS/NRAS/PIK3CA/BRAF基因37種突變檢測(cè)和內(nèi)控試劑，突變由FAM信號(hào)指示，內(nèi)控由HEX(或VIC)信號(hào)指示；12號(hào)管作為DNA提取質(zhì)量的外控檢測(cè)管，亦由FAM信號(hào)指示。本發(fā)明可以實(shí)現(xiàn)一次性檢測(cè)DNA的KRAS/NRAS/PIK3CA/BRAF基因37種突變，大大縮短了檢測(cè)的時(shí)間，靈敏度高，特異性強(qiáng)，操作簡便快捷，可為臨床醫(yī)生對(duì)腸癌患者選擇腫瘤靶向藥物治療提供參考。
【IPC分類】C12Q1-68, C12N15-11
【公開號(hào)】CN104818317
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410213583
【發(fā)明人】江風(fēng)閣, 林清華, 曹櫻, 陳婷, 宋慶濤, 阮力, 鄭立謀
【申請(qǐng)人】廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司
【公開日】2015年8月5日
【申請(qǐng)日】2014年5月20日