的實(shí)時(shí)定量 pcr 檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種黃曲霉毒素的檢測(cè)方法，尤其涉及一種基于適配體的生物傳感 器結(jié)合實(shí)時(shí)定量PCR的黃曲霉毒素&的檢測(cè)方法，屬于黃曲霉毒素&的定量檢測(cè)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 黃曲霉毒素是最重要的霉菌毒素之一，是由包括黃曲霉和寄生曲霉的霉菌產(chǎn)生的 有毒次級(jí)代謝產(chǎn)物，在黃曲霉毒素的幾種亞型中（BpB2,GpG2和M)，AFBi的毒性最強(qiáng)，因此 八?81被世界衛(wèi)生組織（WHO)國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)指定為主要致癌物。由于霉菌毒素對(duì)動(dòng)物和 人類產(chǎn)生的毒性效應(yīng)，霉菌毒素污染在飼料和食品安全領(lǐng)域已經(jīng)引起了全球的廣泛關(guān)注。
[0003]AFBi可以直接污染食品（例如在高溫潮濕環(huán)境下谷類，堅(jiān)果）或者間接污染飼料， 動(dòng)物采食AFBi后，在奶中產(chǎn)生代謝物。為了阻止由于污染的飼料和食品的召回帶來(lái)的食品 安全恐慌和經(jīng)濟(jì)損失，很多國(guó)家對(duì)黃曲霉毒素進(jìn)行了限量。不同食品AFBi的限量范圍為 0. 05-20ngmL'對(duì)于AFBi低限量，高出現(xiàn)率和其劇毒性表明快速，靈敏和特異性檢測(cè)方法 甚至定量追蹤AFBi的水平是十分必要的。
[0004] 現(xiàn)有的定量檢測(cè)AFBi的方法主要有TLC、HPLC和LC結(jié)合MS技術(shù)。然而，儀器法 需要復(fù)雜的前處理，專業(yè)的操作人員和昂貴的儀器設(shè)備，這些要求限制了儀器法的應(yīng)用。因 此，一些快速篩選方法如ELISA，免疫傳感器和SPR的方法也得到了廣泛的應(yīng)用。但是在運(yùn) 輸和貯存過(guò)程中由于抗體的穩(wěn)定性難以保證，尤其是在受控環(huán)境中時(shí)，限制了這類方法的 應(yīng)用。與抗體有著類似功能的適配體，具有低價(jià)格，高穩(wěn)定性，易修飾和易合成等優(yōu)點(diǎn)，可以 重復(fù)使用和長(zhǎng)時(shí)間保存。除此之外，適配體可以作為PCR擴(kuò)增的模板很大程度上提高檢測(cè) 靈敏度，產(chǎn)生的熒光信號(hào)作為定量檢測(cè)的指示器。但是，基于適配體傳感器的霉菌毒素研究 主要集中于0TA和FBi，可用于霉菌毒素的適配體是十分有限的，有待改進(jìn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種基于適配體的生物傳感器的黃曲霉毒素&的實(shí)時(shí)定量 PCR檢測(cè)方法，該檢測(cè)方法具有線性范圍好、靈敏度高、選擇性好、穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。
[0006] 本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：
[0007] -種檢測(cè)黃曲霉毒素&的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法，該方法包括以下步驟：
[0008] 本發(fā)明公開(kāi)了一種黃曲霉毒素&(AFBJ的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法，該方法利用黃 曲霉毒素&適配體對(duì)黃曲霉毒素氏進(jìn)行識(shí)別，利用實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)黃曲霉毒素&適配體 的互補(bǔ)DNA鏈進(jìn)行擴(kuò)增作為信號(hào)輸出，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)黃曲霉毒素&的識(shí)別和檢測(cè)，所述實(shí)時(shí) 定量PCR檢測(cè)方法包括以下步驟：
[0009] (1)將AFBi的生物素化的適配體與互補(bǔ)單鏈DNA鏈進(jìn)行雜交，得到混合溶液；（2) 將混合溶液加入到PCR管中；（3)將待檢測(cè)的樣品加入到PCR管中；與適配體雜交的互補(bǔ)單 鏈DNA鏈與待檢測(cè)的樣品中的AFBi相結(jié)合，釋放出互補(bǔ)單鏈DNA鏈；去除PCR管中適配體與 黃曲霉毒素&的復(fù)合物以及釋放出的互補(bǔ)DNA鏈；（4)向PCR管中加入特異性的上下游引 物，以固定在PCR管表面的互補(bǔ)單鏈DNA為模板建立RT-qPCR定量檢測(cè)體系，進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增反應(yīng)；(4)根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果，建立黃曲霉毒素氏與擴(kuò)增循環(huán)數(shù)（Ct值）之間的線性關(guān)系， 對(duì)黃曲霉毒素氏的含量進(jìn)行定量分析。
[0010] 本發(fā)明中所述的"AFBi的生物素化的適配體"的核苷酸序列優(yōu)選為SEQIDNo.1 所示的核苷酸序列，在其3'端連有生物素。
[0011] 本發(fā)明中所述的"互補(bǔ)單鏈DNA鏈"的核苷酸序列可以是任何一種能夠與SEQID No. 1所示的核苷酸序列進(jìn)行互補(bǔ)或雜交的序列；本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)SEQIDNo. 1所示的 核苷酸序列很容易設(shè)計(jì)得到，優(yōu)選為SEQIDNo. 2所示的核苷酸序列。
[0012] 本發(fā)明通過(guò)優(yōu)化試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，鏈霉親和素修飾的PCR管與未修飾的PCR管檢測(cè)后的 Ct值有明顯的差異，表明鏈霉親和素修飾的PCR管與生物素化的適配體有很強(qiáng)的結(jié)合能 力。因此，為了達(dá)到更好的檢測(cè)效果，優(yōu)選的，本發(fā)明步驟（2)中將混合溶液加入到固定或 交聯(lián)有鏈霉親和素的PCR管中，能夠有效提高檢測(cè)的靈敏度及準(zhǔn)確性。
[0013] 鏈霉親和素、生物素化的適配體和互補(bǔ)單鏈DNA的濃度在很大程度上會(huì)影響檢 測(cè)效果。本發(fā)明通過(guò)比較不同濃度的鏈霉親和素檢測(cè)出的Ct值，發(fā)現(xiàn)鏈霉親和素濃度為 2. 5ngml/1時(shí)，Ct值達(dá)到最低水平。當(dāng)生物素化的適配體的濃度低于5.OnM時(shí)，適配體的濃 度升高，Ct值相應(yīng)降低。當(dāng)生物素化的適配體的濃度高于5.OnM時(shí)，生物素化的適配體的 濃度升高，Ct值相應(yīng)升高，可能是由于空間位阻產(chǎn)生了這樣的結(jié)果。因此，本發(fā)明最終優(yōu)選 2. 5ngml/1的鏈霉親和素和5.OnM的生物素化的適配體作為優(yōu)化后的濃度用于RT-qPCR檢 測(cè)。
[0014] 固定在PCR管表面的互補(bǔ)單鏈DNA作為PCR擴(kuò)增的模板，其濃度和特異性的PCR 擴(kuò)增引物非常重要并需要優(yōu)化。擴(kuò)增曲線表明互補(bǔ)單鏈DNA濃度與循環(huán)數(shù)的相互關(guān)系，DNA 濃度降低，循環(huán)數(shù)升高。當(dāng)互補(bǔ)單鏈DNA濃度范圍為1X1(T4到10nM之間，顯示了很好的線 性關(guān)系，有很高的相關(guān)系數(shù)（R2 = 0. 9962)，線性回歸方程為Ct= -3. 36611gC+38. 127(Ct 表示循環(huán)數(shù)，C表示AFB^DNA的濃度）?；パa(bǔ)DNA的濃度為10nM是緣于該濃度下檢測(cè)到最 低水平的Ct值。
[0015] 步驟（4)中所述的RT-qPCR定量檢測(cè)體系優(yōu)選按照以下方式建立：
[0016] 50iiLPCR反應(yīng)體系由以下部分組成：濃度范圍1X10-4到10nM之間的互補(bǔ)DNA *5iiL，10iiMj：、Tl1^l**SM^》n2iiL，25iiLSYBR?PremixExTaq?(2X)，liiLR0X Reference Dye II (50X)和15 iiL水。
[0017] 所述上、下游引物的核苷酸序列分別為SEQIDNo. 3和SEQIDNo. 4所示。
[0018]所述的實(shí)時(shí)PCR循環(huán)參數(shù)設(shè)置如下：預(yù)變性30s95°C，變性40個(gè)循環(huán)5s95°C，退 火34s6(TC。每一次退火后進(jìn)行熒光檢測(cè)。熔解曲線分析從60°C-95°C檢測(cè)是否有非特異 性引物產(chǎn)生，條件設(shè)置如下：預(yù)變性15s95°C，變性40個(gè)循環(huán)lmin60°C，退火15s95°C.
[0019] 通過(guò)公式E=10H/Sl°pe)_l計(jì)算擴(kuò)增效率并評(píng)估RT-qPCR的定量效果，其中，E表 示擴(kuò)增效率；slope表示斜率。
[0020] 本發(fā)明通過(guò)對(duì)各種參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，RT-qPCR檢測(cè)出不同濃度的AFBi對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增曲 線所示，AFBi的濃度增加，循環(huán)數(shù)相應(yīng)增加。反應(yīng)體系中AFBi的量越大，釋放的互補(bǔ)DNA的 量越大，導(dǎo)致PCR模板的減少，Ct值的增加。通過(guò)PCR檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程計(jì) 算出樣品中AFBi的含量。AFBi的濃度范圍5X l(T5-5ng ml/1與對(duì)應(yīng)的Ct值之間的校準(zhǔn)曲 線呈線性相關(guān)（R2 = 0. 9932)，線性回歸方程為Ct= 3. 8161gC+24. 622 (Ct表示循環(huán)數(shù)，C表示AFBi的濃度）。檢測(cè)AFBi的檢出限（S/N= 3)為25fgmL'相比已經(jīng)報(bào)道的AFBi檢 測(cè)方法中的檢出限低400倍。與當(dāng)前可用的儀器法和快速篩選方法相比（表1)，本發(fā)明檢 測(cè)AFBi的靈敏度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于現(xiàn)有的檢測(cè)方法的靈敏度。
[0021] 表1現(xiàn)有AFBi檢測(cè)方法的靈敏度數(shù)據(jù)
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 黃曲霉毒素B1的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟：（1)將AFB1的 生物素化的適配體與互補(bǔ)單鏈DNA鏈進(jìn)行雜交，得到混合溶液；（2)將混合溶液加入到PCR 管中；(3)將待檢測(cè)的樣品加入到PCR管中，釋放出互補(bǔ)單鏈DNA鏈；(4)用固定在PCR管表 面的互補(bǔ)單鏈DNA建立RT-qPCR定量檢測(cè)體系進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增反應(yīng)；（4)根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果， 對(duì)樣品中AFB 1的含量進(jìn)行定量分析。
2. 按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述的AFB1的生物素化的適配體的核苷 酸序列為SEQ ID No. 1所示，其3'端連有生物素。
3. 按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述的互補(bǔ)單鏈DNA的核苷酸序列為SEQ ID No. 2 所示。
4. 按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（2)中將混合溶液加入到吸附或交 聯(lián)有鏈霉親和素的PCR管中；優(yōu)選的，鏈霉親和素的濃度為2. 5ng mL'
5. 按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：將AFB1的生物素化的適配體與互補(bǔ)單鏈 DNA鏈按照1:1的體積比進(jìn)行雜交；其中，所述生物素化的適配體濃度為5. OnM。
6. 按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：RT_qPCR定量檢測(cè)體系中互補(bǔ)單鏈DNA濃 度范圍為IXKT4到10nM。
7. 按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（4)中所述的RT-qPCR定量檢測(cè)體 系按照以下方式建立： 50. ii L PCR反應(yīng)體系由以下部分組成：濃度范圍IX KT4到IOnM之間的互補(bǔ)單鏈 DNA 為 5 ii L，10 ii M 上、下游引物分別添加 2 ii L，25 ii L2X SYBR? Premix Ex Taq?， I UL50XR0X Reference Dye II和15 ii L水；所述上、下游引物的核苷酸序列分別為SEQ ID No. 3 和 SEQ ID No. 4 所示。
8. 按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的RT-qPCR反應(yīng)參數(shù)如下：預(yù)變性 30s95°C，變性 40 個(gè)循環(huán) 5s95°C，退火 34s60°C。
9. 按照權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于：根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果，建立黃曲霉毒素B1與擴(kuò)增 循環(huán)數(shù)之間的線性關(guān)系，對(duì)黃曲霉毒素B 1的含量進(jìn)行定量分析。
10. 按照權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于：所述線性關(guān)系的線性回歸方程為：Ct = 3. 8161g C+24. 622,其中，Ct表示循環(huán)數(shù)，C表示AFB1的濃度。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種黃曲霉毒素B1的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法，屬于黃曲霉毒素B1的檢測(cè)領(lǐng)域。本發(fā)明利用黃曲霉毒素B1適配體對(duì)黃曲霉毒素B1進(jìn)行識(shí)別，利用實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)黃曲霉毒素B1適配體的互補(bǔ)DNA鏈進(jìn)行擴(kuò)增作為信號(hào)輸出，根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果，建立黃曲霉毒素B1與擴(kuò)增循環(huán)數(shù)之間的線性關(guān)系，對(duì)黃曲霉毒素B1的含量進(jìn)行定量分析，實(shí)現(xiàn)對(duì)黃曲霉毒素B1的識(shí)別和檢測(cè)。本發(fā)明在線性、靈敏度、回收率、選擇性和重現(xiàn)性等方面做了方法驗(yàn)證，結(jié)果證明本發(fā)明所建立的黃曲霉毒素B1的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法具有線性范圍好、靈敏度高、選擇性好、穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。
【IPC分類】C12Q1-68
【公開(kāi)號(hào)】CN104818319
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410315905
【發(fā)明人】鄭楠, 郭曉東, 文芳, 王海微, 汪慧, 李松勵(lì), 王加啟
【申請(qǐng)人】中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所
【公開(kāi)日】2015年8月5日
【申請(qǐng)日】2014年7月3日