重組代謝微生物及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及重組微生物以及通過對包含CO的底物的微生物發(fā)酵產(chǎn)生萜烯和/或 其前體的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 萜烯是包含五碳異戊二烯單元的天然存在的化合物的多樣化類別。萜烯衍生物包 括萜類化合物（也稱為類異戊二烯），其可由碳主鏈的氧化或重排或者大量官能團(tuán)加成或 重排來形成。
[0003] 萜烯的例子包括：異戊二烯（C5半萜烯）、法呢烯（C15倍半萜烯）、青蒿素（C15 倍半萜烯）、檸檬醛（C10單萜烯）、類胡蘿卜素（C40四萜烯）、薄荷醇（C10單萜烯）、樟腦 (C10單萜烯）和大麻素。
[0004] 萜烯是在多種行業(yè)中使用的有價值的商業(yè)產(chǎn)品。萜烯的最重要用途是作為樹 月旨、溶劑、香料和維生素。舉例來說，異戊二烯用于生產(chǎn)例如用于輪胎工業(yè)中的合成橡膠 (順-1，4-聚異戊二烯）；法呢烯用作用于運輸?shù)哪茉疵芗从萌剂希╠rop-in fuel)或用 作噴氣燃料；青蒿素用作瘧疾藥物；且檸檬醛、類胡蘿卜素、薄荷醇、樟腦和大麻素用于制 造藥物丁二烯且作為芳族成分。
[0005] 萜烯可以由石油化學(xué)來源和萜烯原料（諸如松節(jié)油）產(chǎn)生。舉例來說，異戊二烯 在石油化學(xué)上作為乙烯生產(chǎn)中的石腦油或油裂解的副產(chǎn)品而產(chǎn)生。許多萜烯也以相對小的 量從自然來源中提取。然而，這些生產(chǎn)方法代價昂貴，不可持續(xù)且常導(dǎo)致環(huán)境問題，包括引 起氣候變化。
[0006] 由于異戊二烯的極易燃性質(zhì)，已知的生產(chǎn)方法需要廣泛的保護(hù)來限制著火和爆炸 的可能性。
[0007] 本發(fā)明的目標(biāo)在于克服現(xiàn)有技術(shù)的一種或多種不足，或至少向公眾提供用于生產(chǎn) 萜烯和其它相關(guān)產(chǎn)品的替代方式。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 微生物發(fā)酵提供了一種用于生產(chǎn)萜烯的替代選擇。萜烯在自然界中普遍存在，例 如涉及細(xì)菌細(xì)胞壁生物合成，且它們由一些樹（例如白楊）產(chǎn)生用于保護(hù)葉片免受UV光暴 露。然而，并非所有細(xì)菌都包含必要的細(xì)胞機(jī)制來產(chǎn)生萜烯和/或其前體作為代謝產(chǎn)物。舉 例來說，尚不知道能夠?qū)谎趸嫉牡孜锇l(fā)酵產(chǎn)生諸如乙醇的產(chǎn)物的一氧化碳營養(yǎng)型 產(chǎn)乙酸菌（諸如自產(chǎn)乙醇梭菌（C.autoethanogenum)或楊氏梭菌（C. Ijungdahlii))會產(chǎn) 生且釋放任何萜烯和/或其前體作為代謝產(chǎn)物。另外，尚不知道大多數(shù)細(xì)菌會產(chǎn)生具有商 業(yè)價值的任何萜烯。
[0009] 本發(fā)明一般尤其提供通過將包含CO的底物微生物發(fā)酵來產(chǎn)生一種或多種萜烯和 /或其前體的方法以及用于所述方法中的重組微生物。
[0010] 在第一方面，本發(fā)明提供能夠通過將包含CO的底物發(fā)酵產(chǎn)生一種或多種萜烯和/ 或其前體和任選的一種或多種其它產(chǎn)物的一氧化碳營養(yǎng)型產(chǎn)乙酸的重組微生物。
[0011] 在一個具體實施方案中，將所述微生物改造為適合于表達(dá)甲羥戊酸（MVA)途徑中 的一種或多種在用于產(chǎn)生重組微生物的親本微生物中不存在的酶（本文中可稱為外源性 酶）。在另一個實施方案中，將所述微生物改造為適合于過度表達(dá)甲羥戊酸（MVA)途徑中的 一種或多種在用于產(chǎn)生重組微生物的親本微生物中存在的酶（本文中可稱為內(nèi)源性酶）。
[0012] 在另一個實施方案中，將所述微生物改造為適合于：
[0013] a)表達(dá)甲羥戊酸（MVA)途徑中的一種或多種外源性酶和/或過度表達(dá)甲羥戊酸 (MVA)途徑中的一種或多種內(nèi)源性酶；和
[0014] b)表達(dá)DXS途徑中的一種或多種外源性酶和/或過度表達(dá)DXS途徑中的一種或多 種內(nèi)源性酶。
[0015] 在一個實施方案中，所述來自甲羥戊酸（MVA)途徑的一種或多種酶選自：
[0016] a)硫解酶（EC 2. 3. 1. 9)、
[0017] b) HMG-CoA 合酶（EC 2. 3. 3. 10)、
[0018] c) HMG-CoA 還原酶（EC I. I. 1. 88)、
[0019] d)甲羥戊酸激酶（EC 2. 7. L 36)、
[0020] e)磷酸甲羥戊酸激酶（EC 2. 7. 4. 2)、
[0021] f)二磷酸甲羥戊酸脫羧酶（EC 4. I. 1. 33)，和
[0022] g)它們的任一種的功能等效變體。
[0023] 在另一個實施方案中，所述來自DXS途徑的一種或多種酶選自：
[0024] a) 1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶 DXS (EC: 2. 2. 1. 7)、
[0025] b) 1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸還原異構(gòu)酶DXR (EC: I. I. L 267)、
[0026] c)2-C-甲基-D-赤藻糖醇4-磷酸胞苷?；D(zhuǎn)移酶IspD (EC:2. 7. 7. 60)、
[0027] d)4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藻糖醇激酶 IspE(EC:2. 7. L 148)、
[0028] e) 2-C-甲基-D-赤藻糖醇 2, 4_ 環(huán)二磷酸合酶 IspF (EC: 4. 6. L 12)、
[0029] f) 4-羥基-3-甲基丁-2-烯-1-基二磷酸合酶 IspG(EC: L 17.7. 1)、
[0030] g) 4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸還原酶（EC:1. 17. 1.2)，和
[0031] h)它們的任一種的功能等效變體。
[0032] 在另一個實施方案中，一種或多種其它外源性或內(nèi)源性酶被表達(dá)或過度表達(dá)而導(dǎo) 致產(chǎn)生萜烯化合物或其前體，其中經(jīng)表達(dá)的外源性酶或經(jīng)過度表達(dá)的內(nèi)源性酶選自：
[0033] a)香葉基轉(zhuǎn)移酶（geranyltransferase) Fps (EC: 2· δ. 1. 10)、
[0034] b)七異戊烯基二磷酸合酶（heptaprenyl diphosphate synthase) (EC:2. 5. I. 10),
[0035] c)八異戊烯基二磷酸合酶（octaprenyl diphosphate synthase) (EC:2· 5. I. 90)、
[0036] d)異戊二稀合酶（isoprene synthase) (EC 4· 2· 3· 27)、
[0037] e)異戊烯基二磷酸 δ -異構(gòu)酶（isopentenyl diphosphate delta-isomerase) (EC 5· 3· 3· 2)、
[0038] f)法呢烯合酶（EC 4· 2· 3· 46/EC 4· 2· 3· 47)，和
[0039] g)它們的任一種的功能等效變體。
[0040] 在一個實施方案中，親本微生物能夠?qū)珻O的底物發(fā)酵以產(chǎn)生乙酰基CoA，但 不能將乙?；鵆oA轉(zhuǎn)化成甲羥戊酸或異戊烯基焦磷酸（IPP)，且將重組微生物改造為適合 于表達(dá)一種或多種在甲羥戊酸途徑中所涉及的酶。
[0041] 在一個實施方案中，一種或多種萜烯和/或其前體選自甲羥戊酸、IPP、二甲基烯 丙基焦磷酸（DMPP)、異戊二烯、香葉基焦磷酸（GPP)、法呢基焦磷酸（FPP)和法呢烯。
[0042] 在一個實施方案中，微生物包含一種或多種被改造為適合于增加一種或多種內(nèi)源 性核酸的表達(dá)的外源性核酸且所述一種或多種內(nèi)源性核酸編碼一種或多種前文提到的酶。 [0043] 在一個實施方案中，被改造為適合于增加表達(dá)的一種或多種外源性核酸是調(diào)節(jié)元 件。在一個實施方案中，調(diào)節(jié)元件是啟動子。在一個實施方案中，啟動子是組成型啟動子。 在一個實施方案中，啟動子選自Wood-Ljungdahl基因簇或磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶/乙酸激酶操縱子 啟動子。
[0044] 在一個實施方案中，微生物包含一種或多種編碼且被改造為適合于表達(dá)一種或多 種前文提到的酶的外源性核酸。在一個實施方案中，微生物包含一種或多種編碼且被改造 為適合于表達(dá)所述酶中至少兩種的外源性核酸。在其它實施方案中，微生物包含一種或多 種編碼且被改造為適合于表達(dá)所述酶中至少三種、至少四種、至少五種、至少六種、至少七 種、至少八種、至少九種或九種以上的外源性核酸。
[0045] 在一個實施方案中，一種或多種外源性核酸是核酸構(gòu)建體或載體，在一個具體實 施方案中是編碼以任何組合形式的前文提到的一種或多種酶的質(zhì)粒。
[0046] 在一個實施方案中，外源性核酸是表達(dá)質(zhì)粒。
[0047] 在一個具體實施方案中，親本微生物選自一氧化碳營養(yǎng)型產(chǎn)乙酸的細(xì)菌。在 某些實施方案中，微生物選自：自產(chǎn)乙醇梭菌（Clostridium autoethan ogenum)、楊氏 梭菌（Clostridium ljungdahlii)、拉氏梭菌（Clostridium ragsdal ei)、食一氧化碳 梭菌（Clostridium carboxidivorans)、德雷克氏梭菌（Clostridi um drakei)、奠味 梭菌（Clostridium scatologenes)、醋酸梭菌（Clostridium acet icum)、蟻酸醋酸梭 菌（Clostridium formicoaceticum)、大梭菌（Clostridium ma gnum)、食甲基丁酸桿 菌（Butyribacterium methylotrophicum)、伍氏醋酸桿菌（A cetobacterium woodii)、 巴氏嗜喊菌（Alkalibaculum bacchii)、延長布勞特氏菌（Blautia producta)、粘液真 桿菌（Eubacterium Iimosum)、熱醋穆爾氏菌（Moor ella thermoacetica)、熱自養(yǎng)穆爾 氏菌（Moorella thermautotrophica)、卵形鼠抱菌（Sporomusa ovata)、森林乙酸香蕉 抱菌（Sporomusa silvacetica)、類球鼠抱菌（Sporomusa sphaeroides)、普氏產(chǎn)醋桿菌 (Oxobacter pfennigii)和凱伍熱厭氧桿狀菌（Thermoanaerobacter kiuvi) 〇
[0048] 在一個實施方案中，親本微生物是自產(chǎn)乙醇梭菌或楊氏梭菌。在一個具體實施 方案中，微生物是自產(chǎn)乙醇梭菌DSM23693。在另一個具體實施方案中，微生物是楊氏梭菌 DSM13528(或 ATCC55383)。
[0049] 在一個實施方案中，親本微生物缺少DXS途徑和/或甲羥戊酸（MVA)途徑中的一 個或多個基因。在一個實施方案中，親本微生物缺少一個或多個編碼選自以下的酶的基 因：
[0050] a)硫解酶（EC 2. 3. 1. 9)、
[0051] b) HMG-CoA 合酶（EC 2. 3. 3. 10)、
[0052] c) HMG-CoA 還原酶（EC I. I. 1. 88)、
[0053] d)甲羥戊酸激酶（EC 2· 7. I. 36)、
[0054] e)磷酸甲羥戊酸激酶（EC 2· 7· 4· 2)、
[0055] f)二磷酸甲羥戊酸脫羧酶（EC 4· I. L 33)、
[0056] g) 1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶 DXS (EC: 2· 2. I. 7)、
[0057] h) 1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸還原異構(gòu)酶DXR(EC: I. I. I. 267)、
[0058] i)2-C-甲基-D-赤藻糖醇4-磷酸胞苷?；D(zhuǎn)移酶IspD (EC: 2. 7. 7. 60)、
[0059] j)4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藻糖醇激酶 IspE(EC:2. 7. 1. 148)、
[0060] k) 2-C-甲基-D-赤藻糖醇 2, 4-環(huán)二磷酸合酶 IspF (EC: 4. 6. L 12)、
[0061] 1)4-羥基-3-甲基丁-2-烯-1-基二磷酸合酶 IspG(EC: 1. 17. 7. 1)、
[0062] m) 4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸還原酶（EC: 1. 17. 1.2)，和
[0063] η)它們的任一種的功能等效變體。
[0064] 在第二方面，本發(fā)明提供編碼一種或多種酶的核酸，所述酶在微生物中表達(dá)時使 得所述微生物可以通過將包含CO的底物發(fā)酵而產(chǎn)生一種或多種萜烯和/或其前體。
[0065] 在一個實施方案中，核酸編碼兩種或兩種以上酶，所述酶在微生物中表達(dá)時使得 所述微生物可以通過將包含CO的底物發(fā)酵而產(chǎn)生一種或多種萜烯和/或其前體。在一個 實施方案中，本發(fā)明的核酸編碼所述酶中的至少三種、至少四種、至少五種、至少六種、至少 七種、至少八種、至少九種或九種以上。
[0066] 在一個實施方案中，核酸編碼甲羥戊酸（MVA)途徑中的一種或多種酶。在一個實 施方案中，一種或多種酶選自：
[0067] a)硫解酶（EC 2. 3. L 9)、
[0068] b) HMG-CoA 合酶（EC 2. 3. 3. 10)、
[0069] c) HMG-CoA 還原酶（EC I. I. 1. 88)、
[0070] d)甲羥戊酸激酶（EC 2. 7. L 36)、
[0071] e)磷酸甲羥戊酸激酶（EC 2. 7. 4. 2)、
[0072] f)二磷酸甲羥戊酸脫羧酶（EC 4. I. 1. 33)，和
[0073] g)它們的任一種的功能等效變體。
[0074] 在一個具體實施方