使用人干細(xì)胞樣細(xì)胞和代謝組學(xué)比率預(yù)測(cè)藥物的人發(fā)育毒性的制作方法
【專利說(shuō)明】使用人干細(xì)胞樣細(xì)胞和代謝組學(xué)比率預(yù)測(cè)藥物的人發(fā)育毒 性
[0001] 繼續(xù)申請(qǐng)數(shù)據(jù)
[0002] 本申請(qǐng)要求2012年11月2日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)61/721，746和2013年 5月24日提交的序列號(hào)61/827, 407的權(quán)益，每份申請(qǐng)通過(guò)引用結(jié)合在此。
[0003] 政府資助
[0004] 本發(fā)明是由美國(guó)國(guó)家科學(xué)基金會(huì)（National Science Foundation)資助的在批準(zhǔn) 號(hào)IIP-1058355下由政府支持進(jìn)行的。政府在本發(fā)明中享有某些權(quán)利。
[0005] 背景
[0006] 出生缺陷在所有人類出生的大約3%中有報(bào)導(dǎo)，并且是美國(guó)嬰兒死亡率的最大 起因（霍耶特（Hoyert)等人，2006,小兒科（Pediatrics) ;117:168-183)。暴露于有毒 化學(xué)品和物理藥劑被認(rèn)為對(duì)所有出生缺陷的大約3%負(fù)責(zé)（國(guó)家研宄委員會(huì)（National Research Council)，2000，"發(fā)育毒理學(xué)和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估科學(xué)前沿（Scientific frontiers in developmental toxicology and risk assessment)"，華盛頓，DC:美國(guó)學(xué)術(shù)出版社（The National Academies Press))。
[0007] 理解的是，發(fā)育毒性可引起出生缺陷，并且可產(chǎn)生胚胎致死現(xiàn)象、子宮內(nèi)的生長(zhǎng) 限制（IUGR)、形態(tài)發(fā)育異常（例如骨骼畸形）和功能性毒性，這可導(dǎo)致認(rèn)知障礙例如孤 獨(dú)癥?；瘜W(xué)品暴露在這些障礙的發(fā)作中可發(fā)揮的作用受到越來(lái)越多關(guān)注。確實(shí)，估計(jì) 所有出生缺陷的5%至10%是由在子宮中暴露于誘導(dǎo)胎兒發(fā)育異常的已知致畸劑引起 (貝克曼（Beckman)和布倫特（Brent)，1984,藥理學(xué)年度評(píng)論（Annu Rev Pharmacol); 24:483-500)。對(duì)化學(xué)品暴露可在產(chǎn)生出生缺陷中發(fā)揮的顯著和可預(yù)防的作用存在關(guān) 注（克勞迪奧（Claudio)等人， 2〇01，環(huán)境衛(wèi)生展望（Environm Health Perspect); 109:A254-A261)。
[0008] 然而，這個(gè)關(guān)注難以評(píng)價(jià)，歸因于缺少用于測(cè)試市場(chǎng)上超過(guò)80, 000種化學(xué)品加 上每年引進(jìn)的新的2, 000種化合物的發(fā)育毒性的穩(wěn)健和高效的模型（總審計(jì)局（General Accounting Office) (GAO)，1994,有毒物質(zhì)控制法案：對(duì)使TSCA更有效的立法變化的初 步觀察（Toxic Substances Control Act:Preliminary Observations on Legislative Changes to Make TSCA More Effective)，證言，1994年 7 月 13 日，GA0/T-RCED-94-263) 〇 已經(jīng)對(duì)這些化合物中少于5%進(jìn)行了生殖結(jié)局的測(cè)試，并且對(duì)甚至更少的進(jìn)行了發(fā)育毒性 測(cè)試（環(huán)境保護(hù)辦事處（Environmental Protective Agency) (EPA)，1998,化學(xué)危害性數(shù) 據(jù)可用性研宄（Chemical Hazard Data Availability Study)，污染預(yù)防和毒素辦公室 (Office of Pollution Prevention and Toxins))。盡管已經(jīng)在使用動(dòng)物模型系統(tǒng)以評(píng)估 毒性上進(jìn)行了一些嘗試（皮爾斯瑪（Piersma)，2004,毒物學(xué)通訊（Toxicology Letters); 149:147-53)，在子宮中人的敏感度的內(nèi)在差異已限制了此種模型的預(yù)測(cè)有用性。
[0009] 毒性，具體地發(fā)育毒性，通過(guò)藥物發(fā)育過(guò)程在化合物演進(jìn)中也是一個(gè)主要障礙。當(dāng) 前，毒性測(cè)試是在動(dòng)物模型上進(jìn)行的，作為預(yù)測(cè)化合物暴露的不利影響，具體地對(duì)人胚胎和 胎兒中的發(fā)育和器官發(fā)生的不利影響的一個(gè)手段。有助于FDA批準(zhǔn)調(diào)查中的新的藥物的 大部分流行模型是在兔和大鼠上的整體動(dòng)物研宄（皮爾斯瑪（Piersma)，2004,毒物學(xué)通訊 (Toxicology Letters) ;149:147-53)。體內(nèi)研宄依賴于在孕期和胚胎/胎兒發(fā)育的不同 階段（妊娠的第一周、器官發(fā)生階段和整個(gè)妊娠期）將化合物給予至懷孕的動(dòng)物。然而， 歸因于生化途徑上的不同，這些體內(nèi)動(dòng)物模型受在發(fā)育過(guò)程中對(duì)化學(xué)品化合物的響應(yīng)上缺 少動(dòng)物和人之間生物相關(guān)性的限制。在趨勢(shì)例如劑量敏感性和化合物的藥代動(dòng)力學(xué)加工 上常顯現(xiàn)物種不同。根據(jù)報(bào)導(dǎo)的文獻(xiàn)，動(dòng)物模型在預(yù)測(cè)人對(duì)化合物的發(fā)育響應(yīng)上大約60% 是生效的（格里夫斯（Greaves)等人，2004,自然評(píng)論：藥物發(fā)現(xiàn)（Nat Rev Drug Discov); 3:226-36)。因此，存在對(duì)人的直接預(yù)測(cè)體外模型的需要。
[0010] 在I960年代的薩力多胺（thalidomide)悲劇強(qiáng)調(diào)了臨床前發(fā)育毒性測(cè)試的重要 性、物種間在對(duì)可能致畸化合物的響應(yīng)上的顯著不同、以及此類化合物可如何影響發(fā)育中 的胎兒。薩力多胺在嚙齒動(dòng)物模型上的發(fā)育毒性測(cè)試未指示該化合物在人類中的致畸可 能性。超過(guò)10, 〇〇〇個(gè)在子宮暴露后出生的兒童具有嚴(yán)重的出生缺陷。當(dāng)前用于檢測(cè)發(fā)育 毒性的臨床前模型在人、大鼠和兔（針對(duì)發(fā)育毒性測(cè)試的最常用物種）上具有不同的觀察 到的發(fā)育毒性一致性程度，對(duì)已知人致畸劑具有大約70% -80%-致性（達(dá)斯頓（Daston) GP和努森（Knudsen) TB，2010，"基本概念、當(dāng)前調(diào)控設(shè)計(jì)和解釋（Fundamental concepts， current regulatory design and interpretation) "，于：努森（Knudsen) TB，達(dá)斯屯頁(yè) (Daston) GP，編輯，綜合毒物學(xué)（Comprehensive Toxicology)，第12卷，第2版，紐約：愛(ài)思 唯爾（Elsevier)，第3-9頁(yè)）。數(shù)十年來(lái)這些體內(nèi)動(dòng)物模型需要大數(shù)目的動(dòng)物、公斤數(shù)量的 測(cè)試化合物，并且既耗時(shí)又花錢。歸因于這些模型的成本和復(fù)雜性，對(duì)于開(kāi)發(fā)者來(lái)說(shuō)在該化 合物的生活周期中對(duì)一個(gè)陽(yáng)性發(fā)育毒性信號(hào)產(chǎn)生反應(yīng)的安全性評(píng)估常發(fā)生太晚，并且可導(dǎo) 致該化合物或化合物系列的研發(fā)終止。盡管這些動(dòng)物模型是并且長(zhǎng)久以來(lái)被認(rèn)為是調(diào)控黃 金標(biāo)準(zhǔn)，多個(gè)物種對(duì)一種化合物的響應(yīng)的不同可導(dǎo)致漏失發(fā)育毒性的信號(hào)和生物誤解。同 樣地，需要開(kāi)發(fā)新一代工具，使用人細(xì)胞用于評(píng)估與化學(xué)品暴露相關(guān)的可能的發(fā)育毒性風(fēng) 險(xiǎn)。適當(dāng)?shù)臏y(cè)試也將減少產(chǎn)物發(fā)育時(shí)間，控制成本，并且積極地響應(yīng)降低動(dòng)物使用的要求。 [0011] 因此，需要相關(guān)的、預(yù)測(cè)的、準(zhǔn)確的低成本以及快速的人體外測(cè)試，用于可靠地測(cè) 定藥劑和其他化學(xué)品化合物的發(fā)育毒性。
[0012] 發(fā)明概述
[0013] 本發(fā)明包括一種將測(cè)試化合物分類為致畸劑或非致畸劑的方法，該方法包括：在 存在該測(cè)試化合物的情況下和在不存在該測(cè)試化合物的情況下培養(yǎng)未分化的人干細(xì)胞樣 細(xì)胞（hSLC);測(cè)定在存在該測(cè)試化合物的情況下培養(yǎng)的未分化的hSLC的培養(yǎng)基中鳥(niǎo)氨酸 或其片段、加合物、減去物或損失物的倍數(shù)改變，與在不存在該測(cè)試化合物的情況下培養(yǎng)的 hSLC中的情況進(jìn)行比較；測(cè)定胱氨酸或其片段、加合物、減去物或損失物的倍數(shù)改變，在未 分化的hSLC的培養(yǎng)基中在存在該測(cè)試化合物的情況下培養(yǎng)，與在hSLC中在不存在該測(cè)試 化合物的情況下培養(yǎng)進(jìn)行比較；并且測(cè)定鳥(niǎo)氨酸或其片段、加合物、減去物或損失物的倍 數(shù)改變與胱氨酸或其片段、加合物、減去物或損失物的倍數(shù)改變的比率，其中少于或等于約 0. 88的比率指示了該測(cè)試化合物的致畸性并且大于約0. 88的比率指示了該測(cè)試化合物的 非致畸性。
[0014] 本發(fā)明包括預(yù)測(cè)一種測(cè)試化合物的致畸性的方法，該方法包括：在存在該測(cè)試化 合物的情況下和在不存在該測(cè)試化合物的情況下培養(yǎng)未分化的人干細(xì)胞樣細(xì)胞（hSLC); 測(cè)定在存在該測(cè)試化合物的情況下培養(yǎng)的未分化的hSLC的培養(yǎng)基中鳥(niǎo)氨酸或其片段、加 合物、減去物或損失物的倍數(shù)改變，與在不存在該測(cè)試化合物的情況下培養(yǎng)的hSLC中的情 況進(jìn)行比較；測(cè)定胱氨酸或其片段、加合物、減去物或損失物的倍數(shù)改變，在未分化的hSLC 的培養(yǎng)基中在存在該測(cè)試化合物的情況下培養(yǎng)，與在hSLC中在不存在該測(cè)試化合物的情 況下培養(yǎng)進(jìn)行比較；并且測(cè)定鳥(niǎo)氨酸或其片段、加合物、減去物或損失物的倍數(shù)改變與胱氨 酸或其片段、加合物、減去物或損失物的倍數(shù)改變的比率，其中少于或等于約0.88的比率 指示了該測(cè)試化合物的致畸性；并且大于約〇. 88的比率指示了該測(cè)試化合物的非致畸性。
[0015] 本發(fā)明包括用于將一種測(cè)試化合物確認(rèn)為一種致畸劑的方法，該方法包括：在存 在該測(cè)試化合物的情況下和在不存在該測(cè)試化合物的情況下培養(yǎng)未分化的人干細(xì)胞樣細(xì) 胞（hSLC);測(cè)定在存在該測(cè)試化合物的情況下培養(yǎng)的未分化的hSLC的培養(yǎng)基中鳥(niǎo)氨酸或 其片段、加合物、減去物或損失物的倍數(shù)改變，與在不存在該測(cè)試化合物的情況下培養(yǎng)的 hSLC中的情況進(jìn)行比較；測(cè)定胱氨酸或其片段、加合物、減去物或損失物的倍數(shù)改變，在未 分化的hSLC的培養(yǎng)基中在存在該測(cè)試化合物的情況下培養(yǎng)，與在hSLC中在不存在該測(cè)試 化合物的情況下培養(yǎng)進(jìn)行比較；并且測(cè)定鳥(niǎo)氨酸或其片段、加合物、減去物或損失物的倍 數(shù)改變與胱氨酸或其片段、加合物、減去物或損失物的倍數(shù)改變的比率，其中少于或等于約 0. 88的比率指示了該測(cè)試化合物的致畸性；并且大于約0. 88的比率指示了該測(cè)試化合物 的非致畸性。
[0016] 本發(fā)明包括用于測(cè)定以下暴露濃度的方法，在該暴露濃度下一種測(cè)試化合物是致 畸的，該方法包括在一系列濃度的該測(cè)試化合物中和在不存在該測(cè)試化合物的情況下培 養(yǎng)未分化的人干細(xì)胞樣細(xì)胞（hSLC);測(cè)定在每個(gè)濃度的該測(cè)試化合物中培養(yǎng)的未分化的 hSLC的培養(yǎng)基中鳥(niǎo)氨酸或其片段、加合物、減去物或損失物的倍數(shù)改變，與在不存在該測(cè)試 化合物的情況下培養(yǎng)的hSLC中的情況進(jìn)行比較；測(cè)定在每個(gè)濃度的該測(cè)試化合物中培養(yǎng) 的未分化的hSLC的培養(yǎng)基中胱氨酸或其片段、加合物、減去物或損失物的倍數(shù)改變，與在 不存在該測(cè)試化合物的情況下培養(yǎng)的hSLC中的情況進(jìn)行比較；并且針對(duì)每個(gè)濃度的測(cè)試 化合物，測(cè)定鳥(niǎo)氨酸或其片段、加合物、減去物或損失物的倍數(shù)改變與胱氨酸或其片段、加 合物、減去物或損失物的倍數(shù)改變的比率，其中在一個(gè)給定濃度的該測(cè)試化合物情況下少 于或等于約0. 88的比率指示了該測(cè)試化合物在該給定濃度下的致畸性；并且在一個(gè)給定 濃度的該測(cè)試化合物情況下大于約0. 88的比率指示了該測(cè)試化合物在該給定濃度下的非 致畸性。
[0017] 在本發(fā)明的方法的一些方面，使用一種物理分離方法鑒定該胱氨酸或其片段、加 合物、減去物或損失物，和/或鳥(niǎo)氨酸或其片段、加合物、減去物或損失物。在一些方面，一 種物理分離方法包括質(zhì)譜法。在一些方面，質(zhì)譜法包括液相色譜法/電噴射離子化質(zhì)譜法。
[0018] 在本發(fā)明的方法的一些方面，使用一種比色或免疫學(xué)測(cè)定測(cè)量該胱氨酸或其片 段、加合物、減去物或損失物，和/或鳥(niǎo)氨酸或其片段、加合物、減去物或損失物。
[0019] 在本發(fā)明的方法的一些方面，hSLC包括人胚胎干細(xì)胞（hESC)、人誘導(dǎo)多能性 (iPS)細(xì)胞、或人胚狀體。
[0020] 在本發(fā)明的方法的一些方面，在一個(gè)濃度的如下測(cè)試化合物中培養(yǎng)該hSLC，所述 測(cè)試化合物包括測(cè)試化合物的人治療Cmax。
[0021] 在本發(fā)明的方法的一些方面，在一系列濃度的該測(cè)試化合物中培養(yǎng)該hSLC。在一 些方面，該系列濃度包括連續(xù)稀釋。在一些方面，該系列濃度包括九個(gè)三倍稀釋。在一些方 面，該系列濃度包括從約0. 04 μ M至約300 μ M、約4 μ M至約30, OOO μ M、和約0.0 OOl μ M至 約10 μ Μ。在一些方面，該系列濃度的該測(cè)試化合物包括測(cè)試化合物的人治療Cmax。
[0022] 在本發(fā)明的方法的一些方面，該方法進(jìn)一步包括檢測(cè)一種或多種與在存在該測(cè)