一種血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]高血壓是一種以動脈收縮壓或舒張壓升高為特征的臨床綜合癥，它伴有心臟、血管、腦和腎等器官器質(zhì)性病變，是導(dǎo)致中風(fēng)、冠心病的危險致病因子，在我國其發(fā)病率在成年人中高達(dá)20%，已經(jīng)成為生命“第一殺手”，防治高血壓成為全球醫(yī)務(wù)界的一項艱巨任務(wù)。高血壓的病因復(fù)雜，已知體內(nèi)許多系統(tǒng)與血壓調(diào)節(jié)有密切關(guān)系，其中最重要的是升壓系統(tǒng)一腎素-血管緊張素系統(tǒng)(Renin-Ang1tensin System, RAS)和降壓系統(tǒng)一激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)(Kallikrein-Kinin System, KKS)。系統(tǒng)中存在的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶是影響RAS和KKS的關(guān)鍵酶。在RAS中，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶水解無升壓活性的血管緊張素I，生成具有升壓活性的血管緊張素II。而在KKS中，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶能夠降解具有降壓活性的緩激肽，使之失去降血壓活性。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶通過以上兩種途徑參與了體內(nèi)血壓調(diào)節(jié)，造成血壓的升高，引發(fā)高血壓。近年來，具有抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶作用的生物活性肽的研宄呈明顯上升趨勢，人們已經(jīng)從很多生物資源中分離得到血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽，來源于食物中的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽具有降壓活性顯著、沒有毒副作用、安全性高、成本低、易吸收等特點，而常規(guī)的降血壓藥都有明顯的副作用，在高血壓已成為危及人類身體健康的主要疾病的今天，食物中血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽更加符合人們的需求。目前從食物蛋白質(zhì)中通過酶技術(shù)等現(xiàn)代生物技術(shù)獲得血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性肽為高效安全的抗高血壓藥的研宄提供了豐富的依據(jù)。
[0003]海蜇作為一種藥食同源的大型水母，在我國有廣闊的資源分布和悠久的應(yīng)用歷史，早在一千六百多年前就已經(jīng)開始為世人所食用。海蜇除食用外，全身均可入藥，祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為其性味咸平，入肺、肝兩經(jīng)，有潤肺、化痰、止咳、清熱、消食、潤腸等功效。據(jù)李時珍《本草綱目》所述，海蜇“氣味咸溫?zé)o毒、主治婦，入勞損、積血帶下，小兒風(fēng)疾丹毒，燙火傷”等，對氣管炎、哮喘、高血壓、胃潰瘍、單純性甲狀腺腫大等癥均有療效。近年來我國醫(yī)衛(wèi)部門關(guān)于海蜇的藥用價值也有許多報道。認(rèn)為對治療高血壓、慢性氣管炎、哮喘、熱痰咳嗽、胃潰瘍，單純性甲狀腺腫和頸淋巴結(jié)腫等，有一定療效。尤其是海蜇的降壓作用比較顯著，藥理研宄證明:海蜇蛋白酶解產(chǎn)物對腎動脈狹窄高血壓模型動物具有明顯的降壓作用。海蜇主要是由水，蛋白質(zhì)、灰分、碳水化合物、脂肪等物質(zhì)組成。近代研宄分析表明:每10g海蜇食部中，含水分65.0g，灰分18.7g，蛋白質(zhì)12.3g，碳水化合物3.9g，脂肪0.lg，鈣182mg，鐵9.5mg，硫胺素0.0lmg，核黃素0.04mg，尼克酸0.2mg，膽固醇16mg。海蜇的許多藥理活性都與蛋白質(zhì)有關(guān)，由此推測海蜇降壓的主要原因可能是通過所含有的活性肽抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶活性而發(fā)揮作用的。因此海蜇是酶解分離血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的優(yōu)質(zhì)資源。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的第一個目的是提供一種從海蜇中制備的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽，以提供一種新的食物來源的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽。
[0005]該從海蜇中制備的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽具有10個氨基酸，其序列為Gly-P1-Gly-Ala-Ala-Gly-Asp-Asp-Gly-Ala,具有較高的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性。
[0006]本發(fā)明的第二個目的是提供一種從海蜇中制備血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的方法。
[0007]本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)上述發(fā)明目的，所述從海蜇中制備血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的方法，包括
[0008]I)海蜇蛋白酶解產(chǎn)物的制備:海蜇用酸性蛋白酶水解后，收集相對分子質(zhì)量小于3000Da的組分，脫鹽，得到海蜇蛋白酶解產(chǎn)物；
[0009]2)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的分離純化:所述海蜇蛋白酶解產(chǎn)物首先經(jīng)SPSephadex C-25陽離子交換柱分離，收集具有抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶活性的組分，該活性組分再經(jīng)Sephadex G_25凝膠柱和反相高效液相色譜純化。
[0010]SP Sephadex C-25陽離子交換柱洗脫條件為:洗脫液為20mM醋酸緩沖液，pH4.0，洗脫速度為0.6mL/min。
[0011]Sephadex G_25凝膠柱分離條件為:洗脫液為雙蒸水，洗脫速度為0.6mL/min。
[0012]SP Sephadex C-25陽離子交換柱和Sephadex G-25凝膠柱的洗脫液的檢測波長均為280nm ;高效液相色譜的檢測波長為220nm。
[0013]本發(fā)明的優(yōu)點是:1.所制備的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽來源于食物，安全無毒，對血壓正常的人沒有作用，同時經(jīng)過體內(nèi)酶解，有利于消化吸收，降血壓作用顯著；2.采用酶膜耦聯(lián)技術(shù)分離該血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽方法簡單，工序步驟少。
【附圖說明】
[0014]圖1S^hadex C-25 洗脫曲線
[0015]圖2Sephadex G-25 洗脫曲線
[0016]圖32-2組分高效液相分析圖譜(檢測波長220nm)
[0017]圖4Pji分高效液相色譜分析(檢測波長220nm)
【具體實施方式】
[0018]1.血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性的測定
[0019]將Cushman-Cheung(1971)方法略作修改。原理是:在37°C、pH 8.3條件下，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶催化水解血管緊張素I (Ang I )模擬物馬尿酰組氨酰亮氨酸(HHL)產(chǎn)生馬尿酸(Hip)。馬尿酸在紫外228nm處具有特征吸收峰，通過生成物馬尿酸的變化計算血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制率。具體操作如下:用1.5mL離心管，空白對照組加入10yL 5mmol/LHHL,用pH 8.3硼酸緩沖液補足至120 μ L，37°C恒溫水浴保溫5min，加入5 μ L 0.lU/mL血管緊張素轉(zhuǎn)化酶啟動反應(yīng)；樣品組加入100 μ L 5mmol/L HHL和20 μ L水解液后，37°C恒溫水浴保溫5min，加入5μL 0.lU/mL血管緊張素轉(zhuǎn)化酶啟動反應(yīng)，之后兩組均在37°C恒溫保持30min后，加入lmol/L HCl 200 μ L中止反應(yīng)，再加入1.5ml冷的乙酸乙酯，振搖15s，4000r/min離心1min后取出1.0mL乙酸乙酯層轉(zhuǎn)入另一離心管中，置于95°C烘箱中烘干，再用ImL去離子水溶解后，在228nm處測定吸光值。
[0020]ACE抑制活性按照下式計算:
[0021]ACE 抑制率(% ) = [ (A0-As) /A0] X 100%
[0022]其中，Atl為不存在抑制劑時的吸光值;A 3為存在樣品與酶時的吸光值。
[0023]用IC5tl表示抑制率為50%時ACE活性所需的抑制劑的濃度。
[0024]2.海蜇蛋白酶解產(chǎn)物的制備
[0025]將三礬海蜇洗凈除去泥沙等雜質(zhì)，切塊，加入10倍量水，浸泡5?6小時，用清水洗滌后，重復(fù)上述操作三次，瀝干后加10倍量水打漿，以海蜇蛋白含量計，先加入2%胃蛋白酶，調(diào)整pH至3.0，37°C水解4h后，再加入6 %木瓜蛋白酶，調(diào)整pH至5.0，50°C水解Ih，100°C加熱lOmin，滅酶后，4000轉(zhuǎn)/分離心15min，取上清液。
[0026]采用分子量為3000Da的超濾膜將酶解液過濾，收集超濾分子量小于3000Da的部分，再進行納濾處理脫鹽，得海蜇蛋白酶解液。納濾條件:分子量為150?300截留膜，進膜壓力llBar，出膜壓力llBar。將海蜇蛋白酶解液冷凍干燥，冷凍干燥條件:溫度O?50min，0°C升至 20°C ;50 ?300min，20°C ；300 ?350min，20°C升至 40°C ；350 ?750min，40°C ；750 ?800min，40 °C降至20 °C ;真空度為40pa，溫度-30 °C，得到海蜇蛋白酶解產(chǎn)物。
[0027]3.血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的分離純化
[0028](I)Sephadex C-25陽離子交換柱分離純化
[0029]上述海蜇蛋白酶解產(chǎn)物經(jīng)Sephadex C_25凝膠柱分離后，可得到3個峰。如圖1所示。組分1，2和3的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制率分別為IC5tl= 2.62mg/ml, 2.87mg/ml和0.65mg/mlo將活性最高的組分3收集凍干后備用。
[0030](2) Sephadex G-25 分離純化
[0031]組分3經(jīng)過S印hadex G_25進一步分離純化，可以得到2個主要峰。如圖2所示。組分3-1和3-2的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制率分別為IC5tl= 1.97mg/ml和0.16mg/ml?將活性較高組分3-2收集凍干待后續(xù)分離。
[0032](3)高效液相色譜分析
[0033]樣品3-2經(jīng)過高效液相進一步分離純化如圖3，收集活性肽Pl(保留時間為25.17min)。收集色譜峰后，對其進行了純度的檢測，由圖4可知，分離純化血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽純度較高，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性IC5tl為26.34±2.39 μ g/mL?？梢赃M行后續(xù)的氨基酸序列分析。
[0034]4.氨基酸序列分析
[0035]利用埃德曼降解法(Edman降解法)，對所制備的活性肽段Pl進行了氨基酸序列分析，其結(jié)構(gòu)序列為 Gly-Pro-Gly-Ala-Ala-Gly-Asp-Asp-Gly-Ala。
【主權(quán)項】
1.一種從海蜇中制備的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽，其特征是:其氨基酸序列為Gly-Pro-Gly-Ala-Ala-Gly-Asp-Asp-Gly-Alaο
2.—種從海蜇中制備血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的方法，包括 1)海蜇蛋白酶解產(chǎn)物的制備:海蜇用酸性蛋白酶水解后，收集相對分子質(zhì)量小于3000Da的組分，脫鹽，得到海蜇蛋白酶解產(chǎn)物； 2)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的分離純化:所述海蜇蛋白酶解產(chǎn)物首先經(jīng)SPSephadexC-25陽離子交換柱分離，再經(jīng)S印hadex G_25凝膠柱和反相高效液相色譜純化，收集具有抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶活性的組分， SP Sephadex C-25陽離子交換柱洗脫液為醋酸緩沖液，Sephadex G-25凝膠柱洗脫液為雙蒸水。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽及其制備方法，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的氨基酸序列為Gly-Pro-Gly-Ala-Ala-Gly-Asp-Asp-Gly-Ala。本發(fā)明所制備的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽來源于食物，安全無毒，對血壓正常的人沒有作用，同時經(jīng)過體內(nèi)酶解，有利于消化吸收，降血壓作用顯著；采用酶膜耦聯(lián)技術(shù)分離該血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽方法簡單，工序步驟少。
【IPC分類】C07K1-16, C12P21-06, A61P9-12, C07K1-20, C07K1-18, C07K7-06
【公開號】CN104829689
【申請?zhí)枴緾N201510217366
【發(fā)明人】孫振亮, 馮景
【申請人】上海市奉賢區(qū)中心醫(yī)院
【公開日】2015年8月12日
【申請日】2015年4月30日