一種白細(xì)胞介素-6單克隆抗體的制備方法
【專利說(shuō)明】
(一)技術(shù)領(lǐng)域:
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是一種白細(xì)胞介素-6單克隆抗體的制備方法。
(二)【背景技術(shù)】:
[0002]皮炎是皮膚的常見(jiàn)病多發(fā)病，在世界各國(guó)人群中的發(fā)病率約為2_5 % ο其發(fā)病的細(xì)胞和分子機(jī)理已在近幾年中得到闡明。它是由于機(jī)體內(nèi)在的遺傳和外界的環(huán)境等綜合因素引起的炎癥性疾病。表皮角質(zhì)化細(xì)胞在各種因素刺激下可誘導(dǎo)和產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，特別是白細(xì)胞介素-6(IL-6)，IL-6是一種強(qiáng)烈的嗜中性白細(xì)胞化學(xué)趨向因子，能強(qiáng)力地募集和激活嗜中性白細(xì)胞。在外源或內(nèi)源性的刺激下，多種細(xì)胞(包括單核細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，T淋巴細(xì)胞，嗜中性粒細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，角質(zhì)化細(xì)胞等)會(huì)分泌過(guò)量的白細(xì)胞介素_6，使IL-6在皮膚局部的濃度高于正常水平。IL-6就會(huì)和攜帶IL-6受體的細(xì)胞表面受體結(jié)合，激活這些細(xì)胞，引起過(guò)度地增生。同時(shí)，被激活的細(xì)胞又大量分泌IL-6，募集全身的嗜中性細(xì)胞匯集到皮膚病灶部位，浸潤(rùn)和損傷正常皮膚，形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致難以醫(yī)治的種皮膚炎癥性疾病。
[0003]應(yīng)用具有高特異性和中和活性的抗IL-6抗體，可以有效地中和及消除表皮中過(guò)量的IL-6，從而阻斷或減少嗜中性白細(xì)胞的募集和浸潤(rùn)，阻斷炎癥反應(yīng)的惡性循環(huán)，達(dá)到治療炎癥皮膚病灶，使表皮得以恢復(fù)正常的效果。
(三)
【發(fā)明內(nèi)容】
:
[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種制備白細(xì)胞介素-6的單克隆抗體的制備方法，它針對(duì)上述情況，發(fā)明一種操作簡(jiǎn)便、成本低廉、高效的制備方法。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案:一種制備白細(xì)胞介素-6的單克隆抗體的方法，其特征在于它包括以下步驟:
[0006](I)收集大量炎性細(xì)胞樣本及正常細(xì)胞樣本，并通過(guò)同位素標(biāo)記，多維液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法分析在皮炎細(xì)胞中特異表達(dá)的白細(xì)胞介素-6，對(duì)這些蛋白進(jìn)行分離純化；
[0007](2)完成白細(xì)胞介素-6單克隆抗體的表達(dá)和純化；
[0008]1、用分離純化出來(lái)的白細(xì)胞介素-6進(jìn)行動(dòng)物免疫。選擇6-8周齡的雌性BALB/c小鼠。按照每只鼠10ug的量，與等體積的完全弗氏佐劑混合乳化，乳濁液皮下多點(diǎn)注射。2-3周后加強(qiáng)免疫，抗原劑量同上，與弗氏不完全佐劑混合乳化，乳濁液皮下多點(diǎn)或腹腔內(nèi)注射。免疫7-10天后小鼠尾靜脈采血，收集血清。間接法ELISA測(cè)定血清中針對(duì)的抗體滴度。如果抗體滴度在1: 10000以上，可以在融合前三天加強(qiáng)免疫，100 μ L的PBS溶解50ug白細(xì)胞介素-6腹腔內(nèi)注射或靜脈注射。否則，繼續(xù)進(jìn)行每?jī)芍芤淮蚊庖?，直到達(dá)到較高的抗體滴度。
[0009]2、細(xì)胞融合和篩選。為了產(chǎn)生分泌治療白細(xì)胞介素-6細(xì)胞因子的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的骨髓瘤細(xì)胞與免疫小鼠脾細(xì)胞的單細(xì)胞懸液混合，然后在聚乙二醇(PEG)介導(dǎo)的條件下融合:脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞在10: I的比例混合。將細(xì)胞的混合物用無(wú)血清MDM培養(yǎng)基洗滌至少3次。于37°C水浴中，向細(xì)胞團(tuán)中逐滴加入50% PEG，并輕輕搖動(dòng)細(xì)胞沉淀，再經(jīng)無(wú)血清的MDM培養(yǎng)基洗滌I次。用含有HAT的完全培養(yǎng)基重懸融合后的細(xì)胞團(tuán)，輕輕吹打至細(xì)胞團(tuán)散開(kāi)，并按200ul/well接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。之后，每隔2-3天半量更換培養(yǎng)基，直到雜交瘤細(xì)胞克隆足夠大可以篩選。間接法ELISA篩選分泌針對(duì)白細(xì)胞介素-6的抗體陽(yáng)性細(xì)胞孔。首次確定為陽(yáng)性細(xì)胞孔，經(jīng)過(guò)有限稀釋法，至少亞克隆3次，保證陽(yáng)性率在100%，獲得可以穩(wěn)定分泌白細(xì)胞介素-6抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
[0010]3、腹水制備:選擇6-8周齡的BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5ml石蠟油，7_10天后注射雜交瘤細(xì)胞。注射細(xì)胞后10天左右收集腹水，protein G/A柱子純化腹水，獲得純度較高的白細(xì)胞介素-6的單克隆抗體。
(四)【具體實(shí)施方式】:
[0011]以下將通過(guò)【具體實(shí)施方式】的形式再對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅局限于以下的【具體實(shí)施方式】，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
[0012]實(shí)施例1:白細(xì)胞介素-6的獲得
[0013]通過(guò)同位素標(biāo)記、多維液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法分析200多個(gè)炎性細(xì)胞樣本與200多個(gè)正常細(xì)胞樣本，找出白細(xì)胞介素_6，分離純化出它；
[0014]實(shí)施例2:白細(xì)胞介素-6單克隆抗體的表達(dá)
[0015]1、用分離純化出來(lái)的細(xì)胞因子進(jìn)行動(dòng)物免疫。
[0016]選擇6-8周齡的雌性BALB/c小鼠。按照每只鼠10ug的量，與等體積的完全弗氏佐劑混合乳化，乳濁液皮下多點(diǎn)注射。2-3周后加強(qiáng)免疫，抗原劑量同上，與弗氏不完全佐劑混合乳化，乳濁液皮下多點(diǎn)或腹腔內(nèi)注射。免疫7-10天后小鼠尾靜脈采血，收集血清。間接法ELISA測(cè)定血清中針對(duì)的抗體滴度。如果抗體滴度在1:1w以上，可以在融合前三天加強(qiáng)免疫，100 μ L的PBS溶解50ug白細(xì)胞介素-6腹腔內(nèi)注射或靜脈注射。否則，繼續(xù)進(jìn)行每?jī)芍芤淮蚊庖撸钡竭_(dá)到較高的抗體滴度。
[0017]2、細(xì)胞融合和篩選。
[0018]為了產(chǎn)生白細(xì)胞介素-6的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的骨髓瘤細(xì)胞與免疫小鼠脾細(xì)胞的單細(xì)胞懸液混合，然后在聚乙二醇(PEG)介導(dǎo)的條件下融合:脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞在10: I的比例混合。將細(xì)胞的混合物用無(wú)血清MDM培養(yǎng)基洗滌至少3次。于37°C水浴中，向細(xì)胞團(tuán)中逐滴加入50% PEG，并輕輕搖動(dòng)細(xì)胞沉淀，再經(jīng)無(wú)血清的MDM培養(yǎng)基洗滌I次。用含有HAT的完全培養(yǎng)基重懸融合后的細(xì)胞團(tuán)，輕輕吹打至細(xì)胞團(tuán)散開(kāi)，并按200ul/well接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。之后，每隔2_3天半量更換培養(yǎng)基，直到雜交瘤細(xì)胞克隆足夠大可以篩選。間接法ELISA篩選分泌針對(duì)白細(xì)胞介素-6的抗體陽(yáng)性細(xì)胞孔。首次確定為陽(yáng)性細(xì)胞孔，經(jīng)過(guò)有限稀釋法，至少亞克隆3次，保證陽(yáng)性率在100%，獲得可以穩(wěn)定分泌白細(xì)胞介素-6抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
[0019]實(shí)施例3:白細(xì)胞介素-6的單克隆抗體的純化
[0020]選擇6-8周齡的BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5ml石錯(cuò)油，7_10天后注射雜交瘤細(xì)胞。注射細(xì)胞后10天左右收集腹水，protein G/A柱子純化腹水，獲得純度較高白細(xì)胞介素-6的單克隆抗體。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種白細(xì)胞介素-6單克隆抗體的制備方法，其特征在于它包括以下步驟:(I)細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-6的分離純化；(2)白細(xì)胞介素-6的單克隆抗體的表達(dá)；(3)白細(xì)胞介素-6單克隆抗體的純化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備白細(xì)胞介素-6單克隆抗體的方法，其特征在于通過(guò)同位素標(biāo)記、多維液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法找出在炎性細(xì)胞中特異表達(dá)的白細(xì)胞介素-6。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備白細(xì)胞介素-6單克隆抗體的方法，其特征在于，用在炎性細(xì)胞中特異表達(dá)的白細(xì)胞介素-6對(duì)小鼠進(jìn)行免疫，如果抗體滴度在I: 8000-1: 12000以上時(shí)，可將免疫小鼠脾細(xì)胞與對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的骨髓瘤細(xì)胞融合并篩選。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備白細(xì)胞介素-6單克隆抗體的制備方法，其特征在于向小鼠腹腔注射雜交瘤細(xì)胞，注射細(xì)胞后8-12天收集腹水，protein G/A柱子純化腹水，獲得白細(xì)胞介素-6的單克隆抗體。
【專利摘要】本發(fā)明涉及的是一種制備白細(xì)胞介素-6單克隆抗體的方法，其特征在于，通過(guò)同位素標(biāo)記，多維液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法分析在炎性細(xì)胞中特異表達(dá)的細(xì)胞因子，對(duì)這些蛋白進(jìn)行分離純化；用分離純化出來(lái)的炎性細(xì)胞中特異表達(dá)的細(xì)胞因子對(duì)6-8周齡的雌性BALB/c小鼠進(jìn)行免疫，如果抗體滴度在1∶10000以上時(shí)，可將免疫小鼠脾細(xì)胞的單細(xì)胞懸液與對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的骨髓瘤細(xì)胞融合并篩選，得到分泌白細(xì)胞介素-6的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞；向6-8周齡的BALB/c小鼠腹腔注射雜交瘤細(xì)胞，注射細(xì)胞后10天左右收集腹水，protein G/A柱子純化腹水，獲得純度較高的白細(xì)胞介素-6的單克隆抗體。
【IPC分類】C07K16-24
【公開(kāi)號(hào)】CN104829717
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510218440
【發(fā)明人】李鳳娟, 張釋元, 劉洋, 候依萍, 黃雪雪, 蔣坤
【申請(qǐng)人】天津工業(yè)大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年8月12日
【申請(qǐng)日】2015年4月28日