一種雙特異性抗體her2xcd3的構(gòu)建及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及免疫學(xué)的技術(shù)領(lǐng)域。具體地說(shuō)，設(shè)及雙特異性抗體的構(gòu)建和制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 雙特異性抗體化ispecific antibody, BiAb)是含有兩種特異性抗原結(jié)合位點(diǎn)的 人工抗體，能在祀細(xì)胞和功能分子（細(xì)胞）之間架起橋梁，產(chǎn)生導(dǎo)向性的效應(yīng)功能。BiAb在 生物醫(yī)學(xué)中，特別是在腫瘤的免疫治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。通過(guò)BiAb介導(dǎo)細(xì)胞毒作用 殺死腫瘤細(xì)胞是當(dāng)前免疫治療應(yīng)用研究的熱點(diǎn)，其主要特點(diǎn)是BiAb能同時(shí)結(jié)合腫瘤相關(guān) 抗原和免疫效應(yīng)細(xì)胞上的祀分子，直接觸發(fā)免疫效應(yīng)細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷。W下 是針對(duì)所研究的免疫細(xì)胞抗原和腫瘤細(xì)胞抗原，W及相關(guān)技術(shù)發(fā)展的一些【背景技術(shù)】介紹。
[0003] 1.CD3
[0004] CD3分子由4個(gè)亞基組成；5、e、丫、C，其分子質(zhì)量分別為18. 9kDa、23.IkDa、 20. 5kDa、18. 7kDa，其長(zhǎng)度分別有171、207、182、164個(gè)氨基酸殘基。它們一起組成6條膚鏈， 常與T細(xì)胞受體（Tcellrec巧tor，TCR)緊密結(jié)合形成含有8條膚鏈的TCR-CD3復(fù)合體，結(jié) 構(gòu)示意圖見(jiàn)圖1。此復(fù)合體具有T細(xì)胞活化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，穩(wěn)定TCR結(jié)構(gòu)的功能。CD3胞質(zhì)段含免 疫受體酪氨酸活化基序（immunoreceptortyrosine-basedactivationmotif,ITAM)，TCR 識(shí)別并結(jié)合由MHC(majorhisto-compatibilitycomplex)分子提呈的抗原膚，導(dǎo)致CD3的 ITAM的保守序列的酪氨酸殘基被T細(xì)胞內(nèi)的酪氨酸蛋白激酶p561ck磯酸化，然后可募集其 他含有甜2(Scrhomology2)結(jié)構(gòu)域的酪氨酸蛋白激酶（如ZAP-70)。ITAM的磯酸化和與 ZAP-70的結(jié)合是T細(xì)胞活化信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程早期階段的重要生化反應(yīng)之一。因此，CD3分子 的功能是轉(zhuǎn)導(dǎo)TCR識(shí)別抗原所產(chǎn)生的活化信號(hào)。
[0005] 2.肥R2
[0006] 1981 年化；Lh等（ShihC,化化yLC,MurrayM,etal."Transforminggenes ofcarcinomasandneuroblastomasintroducedintomousefibroblasts[J]. 化化re, 1981,290(5803) :261-264.)首次從大鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤基因組中克隆出癌基因 neu，Slamon等（1987，Science2;35;177-182)從人cDNA文庫(kù)中分離出肥R2 基因。隨后 的序列分析和染色體譜分析發(fā)現(xiàn)neu和肥R2為同一個(gè)基因，習(xí)慣上稱為肥R2/neu基因或 c-erbB-2基因。肥R2是人類表皮生長(zhǎng)因子受體家族的第2個(gè)成員，該家族屬于I型受體酪 氨酸激酶，又稱化bB受體家族，其在許多正常和異常表皮細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和轉(zhuǎn)移過(guò)程中 起著重要的調(diào)控作用，許多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和病情輕重與其活性大小密切相關(guān)。家族內(nèi)共 有四個(gè)受體；肥R1，肥R2,肥R3和肥R4。該些受體可W相互作用產(chǎn)生異源或同源二聚體，激 活細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其中肥R2在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起著重要作用。肥R2的結(jié)構(gòu) 包括胞外生長(zhǎng)因子的結(jié)合區(qū)，親脂的跨膜區(qū)和帶有調(diào)節(jié)駿基末端片段的胞內(nèi)區(qū)。肥R2受體 胞內(nèi)區(qū)有酪氨酸蛋白激酶PTK活性，自身也具有若干酪氨酸殘基Tyr磯酸化位點(diǎn)。特異性 生長(zhǎng)因子與HER2受體結(jié)合后可誘導(dǎo)二聚體化并激發(fā)受體的交叉磯酸化，磯酸化的受體可 W把細(xì)胞外的生長(zhǎng)信號(hào)迅速轉(zhuǎn)導(dǎo)至核內(nèi)，刺激控制與細(xì)胞分裂有關(guān)的基因表達(dá)。
[0007] 肥R2定位于人染色體17q21，編碼分子量為185kD的跨膜蛋白，具有酪氨酸激酶RTK活性，正常情況下處于非激活狀態(tài)，參與細(xì)胞正常分化的調(diào)節(jié)，通常只在胎兒期表達(dá)， 成年后，僅在極少數(shù)正常組織內(nèi)微量表達(dá)。正常細(xì)胞中肥R2基因?yàn)?個(gè)拷貝，基因突變 可將其激活，其擴(kuò)增將導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄上調(diào)，蛋白合成增加，從而抑制腫瘤細(xì)胞調(diào)亡，促進(jìn)腫瘤細(xì) 胞增殖，上調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF/血管通透性因子VPF，促進(jìn)腫瘤新生血管生成，增加 腫瘤細(xì)胞侵襲力，破壞機(jī)體組織抗侵襲屏障等[ArtufelMV，ValeroAC，LladoRR，etal. MolecularProtocolforHer-2/neuanalysisinbreastcarcinoma[J].ClinTransl 化col, 2005, 7. (11) : 504-511.]。肥R2蛋白的過(guò)度表達(dá)也在細(xì)胞的分裂、增殖、轉(zhuǎn)化、促進(jìn)腫 瘤的轉(zhuǎn)移、侵襲、粘附中發(fā)揮重要作用出ynes肥,StemDF.HiebiologyoferbB-2/neu/ 肥R-2anditsroleincancer[J].BiochemBio地ysActa, 1994, 1198(2-3):165-184.]。 [000引除可發(fā)生基因突變或擴(kuò)增外，上調(diào)肥R2的表達(dá)也可激肥R2下游的兩個(gè)主要信號(hào) 轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑；MAPK通路，PI3K/Akt通路，從而引發(fā)瀑布式連鎖反應(yīng)，調(diào)節(jié)調(diào)亡相關(guān)基因，促進(jìn) 細(xì)胞無(wú)限增殖分化，抑制調(diào)亡，從而發(fā)生癌變。前者主要參與細(xì)胞的有絲分裂，后者主要影 響細(xì)胞的存活和調(diào)亡。肥R2可通過(guò)MAPK途徑活化Ets轉(zhuǎn)錄因子家族成員ER81而上調(diào)人 端粒末端轉(zhuǎn)移酶逆轉(zhuǎn)錄酶hTERT，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞端粒末端轉(zhuǎn)移酶異常活化，使細(xì)胞轉(zhuǎn)化并 進(jìn)入永久增歹直狀態(tài)[GoueliBS,JanknechtR.Upregulationofthecatalytictelomerase subunitbythetranscriptionfactorERSlandoncogenicHER2/Neu,Ras,orRaf.Mol CellBiol, 2004, 24:25-35. ]。PI3K活化后，可催化磯脂酷肌醇PI生成PIP2和PIP3,它們 是細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，能激活下游的蛋白激酶Akt/PKB，進(jìn)一步導(dǎo)致下游BAD蛋白的磯 酸化，從而阻止BAD與調(diào)亡蛋白Bd-2、Bel-化組成復(fù)合物，同時(shí)還誘導(dǎo)叉頭轉(zhuǎn)錄因子1 磯酸化，從而抑制原調(diào)亡基因的表達(dá)。
[0009] 另外，肥R2癌基因也是腫瘤轉(zhuǎn)移驅(qū)動(dòng)因子，肥R2過(guò)表達(dá)能通過(guò)啟動(dòng)多種轉(zhuǎn)移相關(guān) 機(jī)制而增加腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力，如細(xì)胞遷移率、體外侵襲力、W型膠原酶活性等，還可W影響 某些黏附分子如上皮細(xì)胞巧黏蛋白等的合成，從而促進(jìn)轉(zhuǎn)移。Carter等（CarterW，^^ng J, Boswell C, et al.HER-2/neu over-expression induces endothelial cell retraction[J].Int Cancer, 2001，91(3) :295-299.)研究認(rèn)為，肥R2過(guò)表達(dá)可使內(nèi)皮細(xì)胞 收縮，細(xì)胞間隙增寬，腫瘤細(xì)胞易于從內(nèi)皮細(xì)胞間穿越，腫瘤細(xì)胞發(fā)生移位或轉(zhuǎn)移。多數(shù)研 究認(rèn)為，肥R2基因擴(kuò)增和（或）蛋白過(guò)表達(dá)往往提示腫瘤惡性程度高，轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)。
[0010] 肥R2的過(guò)表達(dá)常與腫瘤的發(fā)生有關(guān)，例如：
[0011] (1)胃癌：胃癌是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，預(yù)后差，進(jìn)展期胃癌5年生存率 僅為5%~20%,中位生存時(shí)間不超過(guò)1年。不同的研究小組檢測(cè)肥R2蛋白在胃癌中過(guò) 表達(dá)的比率變異為7%~43%。肥R2蛋白在胃癌中的陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤分化程度、Lauren分 型及WK)分型有關(guān)，與年齡、性別、腫瘤發(fā)生部位及臨床分期不相關(guān)。
[001引 似乳腺癌：研究表明，肥R2在20%~30%的原發(fā)性乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中有基因 的擴(kuò)增和蛋白的過(guò)度表達(dá)。肥R2的高表達(dá)常導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)移，因此肥R2陽(yáng)性的乳腺 癌浸潤(rùn)性強(qiáng)，無(wú)病生存期短，預(yù)后差。體外實(shí)驗(yàn)顯示，抑制肥R2的表達(dá)可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞 的調(diào)亡。
[0013] (3)卵巢癌；卵巢癌是婦科腫瘤致死的主要原因。卵巢癌中肥R2的過(guò)表達(dá)與乳腺 癌中相似，占 15%~30%。Verri等（VerriE,GuglielminiP,PuntoniM,etal.肥R2/ neuoncoproteinoverexpressioninepithelialovariancancer:evaluationofits prevalenceandprognosticsignificance[J].Oncology, 2005, 68:154-161.)白勺石開(kāi)究 顯示，肥R2陽(yáng)性（2+/3+)患者比陰性患者（0/1+)總生存期顯著降低（29個(gè)月vs48個(gè) 月，P<0. 05)。觀察m、IV期的卵巢癌20個(gè)卵巢細(xì)胞株發(fā)現(xiàn)，均存在肥R2蛋白過(guò)表達(dá)。 [0014] (4)前列腺癌；前列腺癌發(fā)生時(shí)屬于雄激素依賴性，在接受藥物或手術(shù)去勢(shì)治療 后腫瘤退縮，但最終會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)樾奂に胤且蕾囆远^續(xù)生長(zhǎng)，該是目前前列腺癌治療中最主 要的問(wèn)題。研究表明，肥R2是前列腺癌從激素依賴型轉(zhuǎn)變?yōu)榧に胤且蕾囆瓦^(guò)程中的主要介 導(dǎo)者。Signoretti等（SignorettiS,MontironiR,ManolaJ,etal.Her-2-neuexpression andprogressiontowardandrogenindependenceinhumanprostatecancer[J].JNatl CancerInst, 2000, 92:1918-1925.)研究分析不同臨