一種由粗品肝素鈉生產低分子量肝素鈉的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)藥制劑肝素鈉的制備方法領域，具體涉及一種由粗品肝素鈉生產低分子量肝素鈉的方法。
【背景技術】
[0002]肝素鈉是粘多糖硫酸酯類抗凝血藥，屬粘多糖類物質。其藥物功能主要體現在:治療各種疾病并發(fā)的播散性血管內早期凝血；預防動、靜脈血栓和肺栓塞；治療動、靜脈血栓和肺栓塞，缺血性腦卒中，不穩(wěn)定型心絞痛，急性心肌梗塞；人工心肺、腹膜透析或血液透析時作為抗凝血藥物；作為溶血栓療法的維持治療，用于輸血時預防血液凝固及血庫保存鮮血等體外抗凝劑。
[0003]低分子量肝素是從普通肝素通過降解得到的小分子肝素制品，具有生物利用率高、血漿半衰期長等優(yōu)點，特別是其引起的出血副作用大幅降低。目前，低分子量肝素(鈉)的生產制備多是以精品肝素鈉作為起始原料，制得低分子量肝素鈉的成本較高；現有技術CN103214596A公開了一種由肝素鈉粗品直接生產低分子量肝素鈉的方法，該方法采用肝素鈉粗品為原料制備低分子量肝素鈉，但是其制備工藝中僅使用超濾器對肝素中的蛋白等大分子物質進行截留，這樣的處理工藝難免會使肝素鈉成品中殘留一定量的小分子蛋白等雜質，使得最終低分子量肝素鈉的蛋白含量偏高，從而影響低分子量肝素鈉的質量。

【發(fā)明內容】

[0004]針對現有技術不足，本發(fā)明提供了一種由粗品肝素鈉生產低分子量肝素鈉的方法，目的是降低低分子量肝素鈉的生產成本，獲得高純度、高質量的低分子量肝素鈉。
[0005]本發(fā)明解決上述技術問題采用的技術方案為:一種由粗品肝素鈉生產低分子量肝素鈉的方法，具體包括以下步驟:
(I)取一定量粗品肝素鈉溶于濃度為2%的NaCl溶液中，得粗品肝素鈉溶液，加入堿性蛋白酶，于40~50°C下保溫酶解4~5h ；
(2 )將步驟(I)所得酶解液升溫至92~94°C滅活，降溫至40~50 °C，滴加NaOH溶液調節(jié)pH為11~12，加入蒙脫土，攪拌后高速離心，取上層清液；
(3)將所得澄清液降溫至0~4°C之間，加入聚合硅酸鋁鹽，用HCl溶液調節(jié)pH值至2~3，高速離心，棄去不溶雜質；
(4)步驟(3)所得清液加NaOH溶液調節(jié)pH為6~7，加入0.3-0.5倍溶液體積的無水乙醇沉淀，調整溫度至O?4°C，放置6?15h，收集沉淀物，并將沉淀物溶于6~12倍體積的蒸飽水中，完全溶解后，加入溶液體積0.5~1￥%的過氧化氫氧化8~12h，用濾膜過濾，加入溶液體積2倍量的乙醇沉淀，沉淀放置6~15h，得到沉淀物；
(5)將步驟(4)所得沉淀物溶于蒸餾水中，攪拌下緩慢加入亞硝酸鈉降解肝素鈉，直至降解反應結束，加入用氫氧化鈉，再加入硼氫化鈉對肝素鈉進行還原，還原結束后使用超濾膜過濾，所得濾液加入2倍的乙醇并充分攪拌，用乙醇脫水，濃縮并冷凍干燥后即得低分子量肝素鈉。
[0006]進一步地，步驟(I)中，所述粗品肝素鈉溶液的濃度為8~10%，所述堿性蛋白酶用量為粗品肝素鈉溶液的0.5~1%。
[0007]進一步地，步驟(2)中，所述蒙脫土的量為步驟(I)所得酶解液質量的0.10-0.15%，所述蒙脫土的目粒度為200~800目。
[0008]進一步地，步驟(5)中，所述沉淀物溶于蒸餾水中所得溶液的濃度為6~8%。
[0009]進一步地，步驟(5)中，所述亞硝酸鈉降解肝素鈉的反應條件為:HC1溶液調節(jié)pH值2.5-3.0，溫度15~18°C，添加亞硝酸鈉直至使用淀粉指示劑檢測溶液不變藍色為止。
[0010]進一步地，步驟(5)中，所述超濾膜過濾條件為:過濾前調節(jié)需要過濾的溶液pH為6~7，溫度20~25°C，超濾膜為5000D的超濾膜。
[0011]本發(fā)明采用粗品肝素鈉作為原料制備低分子量肝素鈉，制備成本低；在制備低分子量肝素鈉的工藝中，使用堿性蛋白酶酶解粗品肝素鈉中含有的蛋白質，目的是進一步純化肝素鈉；在肝素鈉粗品中，有部分肝素分子是和蛋白質分子通過一定的化學鍵連接在一起的，在堿性蛋白酶的作用下，能水解這種連接，從而使肝素游離出來，進一步提高產品的收率，并且，有助于除去這部分蛋白質，獲得純度更高的肝素鈉；使用蒙脫土對堿性蛋白進行加速吸附沉淀，蒙脫土對蛋白質有吸附作用；選用絮凝劑中的聚合硅酸鋁鹽對酸性蛋白進行加速吸附沉淀，在低PH值條件下，聚合硅酸鋁鹽能快速吸附溶液中的酸性蛋白，采用蒙脫土及聚合硅酸鋁鹽吸附蛋白質后再通過高速離心，能很好且更迅速的除去溶液中的各種蛋白成分；綜上所述，該粗品肝素鈉生產低分子量肝素鈉的方法的優(yōu)點是低分子量肝素鈉制備成本低，所得低分子量肝素鈉蛋白含量低、純度高，而且收率高。
【具體實施方式】
[0012]下面結合具體實施例對本發(fā)明做進一步的說明。
[0013]實施例1:一種由粗品肝素鈉生產低分子量肝素鈉的方法，具體包括以下步驟:
(1)取1g粗品肝素鈉溶于10mL濃度為2%的NaCl溶液中，得粗品肝素鈉溶液，加入Ig堿性蛋白酶，于45 °C下保溫酶解4h ；
(2)將步驟(I)所得酶解液升溫至92°C滅活，降溫至45°C，滴加NaOH溶液調節(jié)pH為12，加入蒙脫土，攪拌后高速離心，取上層清液；
(3)將所得澄清液降溫至2°C，加入聚合硅酸鋁鹽，用HCl溶液調節(jié)pH值至2，高速離心，棄去不溶雜質；
(4)步驟(3)所得清液加NaOH溶液調節(jié)pH為6，加入0.5倍溶液體積的無水乙醇沉淀，調整溫度至2V，放置10h，收集沉淀物，并將沉淀物溶于8倍體積的蒸餾水中，完全溶解后，加入溶液體積Iv%的過氧化氫氧化10h，用濾膜過濾，加入溶液體積2倍量的乙醇沉淀，沉淀放置10h，得到沉淀物；
(5)將步驟(4)所得沉淀物溶于蒸餾水中，攪拌下緩慢加入亞硝酸鈉降解肝素鈉，直至降解反應結束，加入用氫氧化鈉，再加入硼氫化鈉對肝素鈉進行還原，還原結束后使用超濾膜過濾，所得濾液加入2倍的乙醇并充分攪拌，用乙醇脫水，濃縮并冷凍干燥后即得低分子量肝素鈉。
[0014]本實施例步驟(2)中，所述蒙脫土的量為步驟(I)所得酶解液質量的0.10%，所述蒙脫土的目粒度為200~800目；步驟(5)中，所述沉淀物溶于蒸餾水中所得溶液的濃度為7% ;步驟(5)中，所述亞硝酸鈉降解肝素鈉的反應條件為:HC1溶液調節(jié)pH值3.0，溫度15°C，添加亞硝酸鈉直至使用淀粉指示劑檢測溶液不變藍色為止；步驟(5)中，所述超濾膜過濾條件為:過濾前調節(jié)需要過濾的溶液PH為6，溫度20°C，超濾膜為5000D的超濾膜。
[0015]實施例2:—種由粗品肝素鈉生產低分子量肝素鈉的方法，具體包括以下步驟:
(1)取1g粗品肝素鈉溶于90mL濃度為2%的NaCl溶液中，得粗品肝素鈉溶液，加入0.5g堿性蛋白酶，于50 °C下保溫酶解4.5h ；
(2)將步驟(I)所得酶解液升溫至93°C滅活，降溫至48°C，滴加NaOH溶液調節(jié)pH為11，加入蒙脫土，攪拌后高速離心，取上層清液；
(3)將所得澄清液降溫至0°C，加入聚合硅酸鋁鹽，用HCl溶液調節(jié)pH值至2，高速離心，棄去不溶雜質；
(4)步驟(3)所得清液加NaOH溶液調節(jié)pH為7，加入0.4倍溶液體積的無水乙醇沉淀，調整溫度至3°C，放置6h，收集沉淀物，并將沉淀物溶于12倍體積的蒸餾水中，完全溶解后，加入溶液體積lv%的過氧化氫氧化llh，用濾膜過濾，加入溶液體積2倍量的乙醇沉淀，沉淀放置7h，得到沉淀物；
(5)將步驟(4)所得沉淀物溶于蒸餾水中，攪拌下緩慢加入亞硝酸鈉降解肝素鈉，直至降解反應結束，加入用氫氧化鈉，再加入硼氫化鈉對肝素鈉進行還原，還原結束后使用超濾膜過濾，所得濾液加入2倍的乙醇并充分攪拌，用乙醇脫水，濃縮并冷凍干燥后即得低分子量肝素鈉。
[0016]本實施例步驟(2)中，所述蒙脫土的量為步驟(I)所得酶解液質量的0.12%，所述蒙脫土的目粒度為200~800目；步驟(5)中，所述沉淀物溶于蒸餾水中所得溶液的濃度為6% ;步驟(5)中，所述亞硝酸鈉降解肝素鈉的反應條件為:HC1溶液調節(jié)pH值3.0，溫度16°C，添加亞硝酸鈉直至使用淀粉指示劑檢測溶液不變藍色為止；步驟(5)中，所述超濾膜過濾條件為:過濾前調節(jié)需要過濾的溶液PH為6，溫度25°C，超濾膜為5000D的超濾膜。
【主權項】
1.一種由粗品肝素鈉生產低分子量肝素鈉的方法，其特征在于，包括以下步驟: (I)取一定量粗品肝素鈉溶于濃度為2%的NaCl溶液中，得粗品肝素鈉溶液，加入堿性蛋白酶，于40~50°C下保溫酶解4~5h ； (2 )將步驟(I)所得酶解液升溫至92~94°C滅活，降溫至40~50 °C，滴加NaOH溶液調節(jié)pH為11~12，加入蒙脫土，攪拌后高速離心，取上層清液； (3)將所得澄清液降溫至0~4°C之間，加入聚合硅酸鋁鹽，用HCl溶液調節(jié)pH值至2~3，高速離心，棄去不溶雜質； (4)步驟(3)所得清液加NaOH溶液調節(jié)pH為6~7，加入0.3-0.5倍溶液體積的無水乙醇沉淀，調整溫度至O?4°C，放置6?15h，收集沉淀物，并將沉淀物溶于6~12倍體積的蒸飽水中，完全溶解后，加入溶液體積0.5~1￥%的過氧化氫氧化8~12h，用濾膜過濾，加入溶液體積2倍量的乙醇沉淀，沉淀放置6~15h，得到沉淀物； (5)將步驟(4)所得沉淀物溶于蒸餾水中，攪拌下緩慢加入亞硝酸鈉降解肝素鈉，直至降解反應結束，加入用氫氧化鈉，再加入硼氫化鈉對肝素鈉進行還原，還原結束后使用超濾膜過濾，所得濾液加入2倍的乙醇并充分攪拌，用乙醇脫水，濃縮并冷凍干燥后即得低分子量肝素鈉。
2.根據權利要求1所述的一種由粗品肝素鈉生產低分子量肝素鈉的方法，其特征在于:步驟(I)中，所述粗品肝素鈉溶液的濃度為8~10%，所述堿性蛋白酶用量為粗品肝素鈉溶液的0.5~1%。
3.根據權利要求1所述的一種由粗品肝素鈉生產低分子量肝素鈉的方法，其特征在于:步驟(2)中，所述蒙脫土的量為步驟(I)所得酶解液質量的0.10-0.15%，所述蒙脫土的目粒度為200~800目。
4.根據權利要求1所述的一種由粗品肝素鈉生產低分子量肝素鈉的方法，其特征在于:步驟(5)中，所述沉淀物溶于蒸餾水中所得溶液的濃度為6~8%。
5.根據權利要求1所述的一種由粗品肝素鈉生產低分子量肝素鈉的方法，其特征在于:步驟(5)中，所述亞硝酸鈉降解肝素鈉的反應條件為:HC1溶液調節(jié)pH值2.5-3.0，溫度15~18°C，添加亞硝酸鈉直至使用淀粉指示劑檢測溶液不變藍色為止。
6.根據權利要求1所述的一種由粗品肝素鈉生產低分子量肝素鈉的方法，其特征在于:步驟(5)中，所述超濾膜過濾條件為:過濾前調節(jié)需要過濾的溶液pH為6~7，溫度20~25°C，超濾膜為5000D的超濾膜。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種由粗品肝素鈉生產低分子量肝素鈉的方法，以粗品肝素鈉為原料，在一定條件下經過純化和降解獲得高純度、高質量的低分子量肝素鈉。本發(fā)明的粗品肝素鈉生產低分子量肝素鈉的方法的優(yōu)點是低分子量肝素鈉制備成本低，所得低分子量肝素鈉蛋白含量低、純度高，而且收率高。
【IPC分類】C08B37-10
【公開號】CN104829751
【申請?zhí)枴緾N201510271193
【發(fā)明人】王芃
【申請人】蘇州鴻洋醫(yī)藥科技有限公司
【公開日】2015年8月12日
【申請日】2015年5月26日