一株有效降解己烯雌酚的黑曲霉的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及利用微生物進(jìn)行環(huán)境治理的領(lǐng)域，具體涉及一株可降解己烯雌酚的黑 曲霉。
【背景技術(shù)】
[0002] 己烯雌酚是一種人工合成的非留體雌激素類(lèi)藥物，曾被用作提高動(dòng)物的繁殖性能 和生產(chǎn)性能的藥物。己烯雌酚作為一種內(nèi)分泌干擾物，能夠引起肝臟損傷，基因突變以及人 體內(nèi)激素失調(diào)，女性乳腺癌、卵巢癌等疾病。己烯雌酚作為一種內(nèi)分泌干擾物，受到科學(xué)界 和公眾的廣泛關(guān)注。由于其對(duì)激素系統(tǒng)有影響，對(duì)機(jī)體具有慢性毒性，1970年被美國(guó)FDA禁 止使用。中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部發(fā)布的《2003年度動(dòng)物性產(chǎn)品中獸藥殘留監(jiān)控計(jì)劃》中要 求己烯雌酚不得在動(dòng)物性食品中檢出。
[0003] 目前己烯雌酚的殘留問(wèn)題仍然很?chē)?yán)重，加泰羅尼亞地區(qū)的污水處理廠排出的廢水 中己烯雌酚的含量為34 ng/L，高舒榭等對(duì)南陽(yáng)市市售雞肉隨機(jī)抽取檢測(cè)的40份樣品中均 檢出了己烯雌酚，殘留量最高的樣品達(dá)10 mg/kg。動(dòng)物養(yǎng)殖戶(hù)違規(guī)使用，化學(xué)排放，污水處 理廠和垃圾填埋場(chǎng)等都可能導(dǎo)致己烯雌酚殘留于動(dòng)物性食品、水體和土壤環(huán)境中。近年來(lái)， 降解或消除己烯雌酚的方法已受到廣泛關(guān)注。
[0004] 微生物降解法被認(rèn)為是消除有害化合物污染的佳選方法之一。徐冉芳等篩選的一 株己稀雌酷降解菌沙雷氏菌S可在7 d內(nèi)降解68. 3%的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中的50 mg/L的己稀 雌酚；張衛(wèi)衛(wèi)等篩選的假單胞菌能有效降解80 mg/L的己烯雌酚，Zhang等篩選了一株對(duì)己 烯雌酚具有降解作用的假單胞菌。目前關(guān)于具有己烯雌酚降解能力的真菌尤其是黑曲霉還 未見(jiàn)報(bào)道。1989年，美國(guó)食品藥物管理局（FDA)和美國(guó)飼料工業(yè)協(xié)會(huì)（AAFCO)公布的42種 "可直接飼喂且通常認(rèn)為是安全的微生物（GRAS)"可作為微生態(tài)制劑的菌種中包括黑曲霉； 2008年，我國(guó)農(nóng)業(yè)部公告(第1126號(hào)）公布的飼料添加劑的菌種中也包括了黑曲霉。本發(fā) 明提供了一株來(lái)源于市售磚茶的具有己烯雌酚降解能力的黑曲霉為環(huán)境中己烯雌酚的有 效去除提供了良好的菌種資源，同時(shí)其來(lái)源和菌種保證其應(yīng)用的安全性，可為環(huán)境和食品 中己烯雌酚的殘留降解或消除提供良好菌源。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一株可有效降解己烯雌酚的菌株一黑曲霉 niger'Ykl〇
[0006] 本發(fā)明所提供的降解菌株為黑曲霉（乂5/76?/^7'77^5 YAT，保藏于中國(guó)普通 微生物菌種保藏管理中心，保藏地點(diǎn)為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院，保藏號(hào)為CGMCC No. 10568,保藏日期為2015年2月11日。
[0007] 所述黑曲霉降解己烯雌酚的步驟為：（1)菌株YAT活化：挑取黑曲霉YAT于PDA培 養(yǎng)基上劃線，28 °C培養(yǎng)72 h。
[0008] (2)菌株YAT降解己烯雌酚：用無(wú)菌生理鹽水將PDA培養(yǎng)基上的孢子洗脫并混勻 制備孢子懸液。移取1 mL孢子懸液接種于裝有29 mL MM培養(yǎng)基(含0. 2%吐溫80)的250 mL三角瓶中，加入己烯雌酚至一定濃度，以1 mL生理鹽水代替菌懸液為空白對(duì)照。28 °C、 180 r/min振蕩培養(yǎng)，定時(shí)取樣，提取己烯雌酚，采用HPLC測(cè)定己烯雌酚降解率。
[0009] 所述微生物降解己烯雌酚體系中己烯雌酚的提取方法為：采用全量(整瓶培養(yǎng)液） 取樣方式，加入30 mL的甲醇，于超聲波清洗器（AS10200A)中超聲提取30 min;取2. 0 mL 超聲提取液于刻度試管中，用甲醇定容至10 mL，混勾，取1.5 mL樣品12 000 r/min離心 15 min，上清液用0. 45 y m有機(jī)相濾膜過(guò)濾，棄去約0. 5 mL初濾液，收集續(xù)濾液為樣品溶 液，供HPLC分析用，儀器為L(zhǎng)C-10A2010C HT型液相色譜儀。
[0010] 所述微生物降解體系中己烯雌酚的HPLC檢測(cè)方法為：LC-10A2010C HT型液相色 譜系統(tǒng)，S印ax GP-C18柱（150 _X4.60 mm，5.0 ym)為色譜柱，甲醇：水（7:3 v/v)為流 動(dòng)相，流速〇. 7 mL/min，進(jìn)樣量10 yL，用紫外檢測(cè)器在242 nm處檢測(cè)。
[0011] 本發(fā)明所用培養(yǎng)基為：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA):新鮮土豆去皮切塊，稱(chēng)取 200 g，加入500 mL蒸餾水煮沸20 min，過(guò)濾，加葡萄糖20 g，瓊脂20 g，再加蒸餾水至1000 mL，121 ° C滅菌15 min;基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基（MM):硫酸銨1.5 g，氯化鈉0.5 g，磷酸氫二鉀1.5 g，磷酸二氫鉀0.5 g，硫酸鎂0.2 g，蒸餾水定容至1000 mL，pH 7.0,121 ° C滅菌15 min。
[0012] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的積極效果是：該黑曲霉降解環(huán)境和食品中的己烯雌酚， 具有菌源安全，降解速度快、費(fèi)用低、操作步驟簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，為徹底清除環(huán)境和食品中的己 烯雌酚殘留提供了較好的資源。
【附圖說(shuō)明】
[0013] 圖1為降解菌株YAT處理前后己烯雌酚的HPLC譜圖，圖中0 h為含接種YAT的20 mg/L己烯雌酚的MM培養(yǎng)基中0 h取樣處理，HPLC檢測(cè)的色譜圖，4 d為培養(yǎng)4 d后取樣進(jìn) 行HPLC檢測(cè)得到的的色譜圖。
[0014] 圖2為降解菌株YAT對(duì)20 mg/L己烯雌酚的降解曲線。圖中，橫坐標(biāo)為培養(yǎng)時(shí)間 (d )，縱坐標(biāo)為己烯雌酚降解率（％)。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 實(shí)例1 :不同培養(yǎng)時(shí)間菌株YAT降解己烯雌酚的情況。
[0016] 種子液制備：挑取YAT菌種于PDA平板上劃線，于28 ° C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h 后挑取單菌落在PDA斜面培養(yǎng)基上劃線，28 ° C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h;用無(wú)菌生理鹽水 將斜面培養(yǎng)基上的YAT菌苔洗脫并混勻制成種子液(孢子濃度約為108 CFU/mL)。
[0017] 取1 mL種子液接種于29 mL(250 mL三角瓶)己烯雌酚濃度為20 mg/L的含0? 2% 吐溫80的麗培養(yǎng)基中，以1 mL生理鹽水代替種子液為空白對(duì)照，28 ° C、180 r/min振蕩 培養(yǎng)4 d，每24 h取樣，甲醇超聲提取，HPLC檢測(cè)己烯雌酚濃度。降解菌株YAT處理前后己 烯雌酚的HPLC譜圖見(jiàn)圖1;降解菌株YAT作用于20 mg/L己烯雌酚的降解曲線見(jiàn)圖2。菌 株YAT對(duì)20 mg/L己烯雌酚具有明顯的降解作用，4 d內(nèi)可降解75. 32 %己烯雌酚。
[0018] 所述己烯雌酚提取方法為：采用整瓶培養(yǎng)液的取樣方式，加入30 mL甲醇，于超聲 波AS10200A清洗器中超聲提取30 min;取2.0 mL超聲提取液于刻度試管中，用甲醇定容 至10 mL，混勾，取1.5 mL樣品12 000 r/min離心15 min，上清液用0. 45 ym有機(jī)相濾膜 過(guò)濾，棄去約0. 5 mL初濾液，收集續(xù)濾液為樣品溶液，供HPLC分析用，儀器為L(zhǎng)C-10A2010C HT型液相色譜儀。
[0019] 所述HPLC檢測(cè)方法為：LC-10A2010C HT型液相色譜系統(tǒng)，S印ax GP-C18柱（150 mmX4.60 mm，5.0 ym)為色譜柱，甲醇：水（7:3 v/v)為流動(dòng)相，流速0.7 mL/min，進(jìn)樣量 10 UL，用紫外檢測(cè)器在242 nm處檢測(cè)。
[0020] 己烯雌酚降解率的計(jì)算公式為：
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一株黑曲霉（flige/OYAT，其特征在于保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏 管理中心，保藏地點(diǎn)為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院，保藏號(hào)為CGMCC No. 10568,保藏日 期為2015年2月11日。
2. 權(quán)利要求1所述黑曲霉（YAT，其特征在于：可有效降解己稀雌 酚，為環(huán)境或食品中己烯雌酚的殘留降解或消除提供良好菌源。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及利用微生物進(jìn)行環(huán)境治理領(lǐng)域，具體地說(shuō)是涉及一株可代謝己烯雌酚的黑曲霉?？纱x己烯雌酚的黑曲霉（Aspergillus niger）菌株號(hào)為YAT，在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC）登記保藏；保藏號(hào)為CGMCC No.10568，保藏日期為2015年2月11日。本發(fā)明提供的黑曲霉能有效降解20mg/L的己烯雌酚，用本菌株可開(kāi)發(fā)相應(yīng)的環(huán)保生物制劑，為降解或清除環(huán)境和食品中的己烯雌酚殘留提供了重要資源，具有良好的應(yīng)用前景。CGMCC No. 1056820150211
【IPC分類(lèi)】A62D101-28, C12R1-685, C02F3-34, C02F101-38, A62D3-02, C12N1-14
【公開(kāi)號(hào)】CN104830699
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510219869
【發(fā)明人】劉書(shū)亮, 胡凱弟, 文濤, 胡露, 羅松明, 胡欣潔, 陳姝娟
【申請(qǐng)人】四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年8月12日
【申請(qǐng)日】2015年5月4日