一種雷氏普羅威登斯菌的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物篩選技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種雷氏普羅威登斯菌。
【背景技術(shù)】
[0002]病原性盾纖毛蟲是我國海水魚工廠化養(yǎng)殖中危害較大的病害之一，其發(fā)生近年來愈加頻繁。盾纖毛蟲屬兼性寄生蟲，一般情況下營自由生活，以懸浮的微小顆粒物質(zhì)(細菌、微藻、原蟲等)為食；但在某些環(huán)境下，這些纖毛蟲可以表現(xiàn)為寄生性，吞噬魚類的細胞和組織殘渣并在其組織內(nèi)生長、繁殖；報道顯示，我國各地工廠化養(yǎng)殖車間從12?26°C均可出現(xiàn)盾纖毛蟲病，幾乎全年均可發(fā)??；盾纖毛蟲病在牙鲆中發(fā)病最為兇猛，控制不力會出現(xiàn)90%以上的死亡率。目前我國海水魚工廠化養(yǎng)殖中所發(fā)現(xiàn)的盾纖類纖毛蟲主要有弗州擬尾絲蟲、蟹棲異阿腦蟲、指狀擬舟蟲、水滴偽康纖蟲、貪食邁阿密蟲。為防控盾纖毛蟲病對我國海水魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的危害，國內(nèi)多家單位針對盾纖毛蟲進行了防治藥物的篩選，但目前水產(chǎn)上對該病的治療仍集中于福爾馬林、硫酸銅、硫酸鋅的使用，這些藥物基本作用于蛋白變性，其雖然可以殺死水體中盾纖毛蟲，但很難根治殺死在魚體內(nèi)的盾纖毛蟲，而且這些藥物對魚和人體細胞沒有鑒別能力，同樣可以發(fā)揮作用，引起嚴(yán)重后果，另外中國專利文獻CN1762460A、CN103349747A公布了兩種中草藥配方的防治牙鲆盾纖毛蟲病的中藥制劑，但該類制劑在實際生產(chǎn)中的應(yīng)用和穩(wěn)定性還需更多檢驗。
[0003]實際上，在自然界，存在著許多對病原害蟲有致病作用的微生物，利用這種致病性來防治病原害蟲是一種有效的生物防治方法。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)和基因工程的發(fā)展以及它們在藥物中的應(yīng)用，高效、低毒、無殘留的微生物防治已成為生物農(nóng)藥研制中較為活躍的研宄領(lǐng)域之一。微生物殺蟲劑就是利用微生物的活體及其代謝產(chǎn)物制成的。從微生物中篩選出施用方便、藥效穩(wěn)定、對人、養(yǎng)殖動物和環(huán)境安全的菌種，進行工業(yè)規(guī)模的生產(chǎn)開發(fā)，從而制成微生物殺蟲劑。微生物殺蟲劑的特點主要是對脊椎動物、人體和環(huán)境無害，且防病對象不易產(chǎn)生抗藥性，微生物殺蟲劑可以說是一種環(huán)保生物農(nóng)藥。另外微生物在生態(tài)環(huán)境中定植后可以自然繁殖，長期發(fā)揮殺滅病原害蟲的目的，這是任何其它藥物所不具備的特點。但目前利用微生物來拮抗防治海水魚類病原性盾纖毛蟲還未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供能夠殺滅海水魚類病原性盾纖毛蟲的微生物，從而彌補現(xiàn)有技術(shù)的不足。
[0005]本發(fā)明提供的雷氏普羅威登斯菌Bg-7 (Providencia rettgeri Bg_7)，已經(jīng)保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研宄所，保藏號為CGMCC N0.9077，保藏日期為2014年04月18號。
[0006]該菌為革蘭氏陰性菌，其接觸酶反應(yīng)為陽性，氧化酶反應(yīng)為陰性，在MA培養(yǎng)基上形成奶白色菌落，菌落為圓形，中間有微凸起；該菌利用檸檬酸鹽反應(yīng)為陽性，發(fā)酵七葉靈檸檬酸鐵、2-酮葡萄糖酸鉀、2-酮葡萄糖酸鉀、甘露醇、肌醇、葡萄糖產(chǎn)酸。
[0007]本發(fā)明的雷氏普羅威登斯菌Bg-7 (Providencia rettgeri Bg_7)在與海水魚類盾纖毛蟲病原共培養(yǎng)時，能夠在24小時內(nèi)殺滅共培養(yǎng)體系中97%以上的盾纖毛蟲，該菌株的發(fā)現(xiàn)為防治海水魚類盾纖毛蟲病提供了新思路。
【具體實施方式】
[0008]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明均為常規(guī)方法。
[0009]海水2216E液體培養(yǎng)基:酵母提取物lg，蛋白胨5g，磷酸鐵0.1g,瓊脂20g，pH7.6?7.8，IL陳海水。
[0010]實施例1 Bg-7菌株的篩選培養(yǎng)
[0011]步驟1.菌株分純培養(yǎng):本發(fā)明所獲得菌株Bg-7的原始樣品采集地點為印度洋(Ε9Γ I，10”;N10° O，10”)，樣品采集后，立即無菌涂布到MA 2216培養(yǎng)基(Difco，貨號:212185)上，用涂布好的培養(yǎng)皿倒置于25°C培養(yǎng)24-96小時，挑取長出的單菌落，在MA 2216培養(yǎng)基平板上進行劃線分純，將劃好線的培養(yǎng)皿倒置于25°C培養(yǎng)24-96小時，挑取長出的單菌落，再次在MA 2216培養(yǎng)基平板上進行劃線分純，將劃好線的培養(yǎng)皿倒置于25°C培養(yǎng)24-96小時，待單一菌落長出，挑取單菌落到Iml海水2216E液體培養(yǎng)基中，并用封口膜密封備用，接種好單菌落的海水2216E液體培養(yǎng)基置于25°C搖菌24-96小時，至其0D_達到
0.4-0.7，用封口膜密封備用。
[0012]步驟2.盾纖毛蟲液制備:取實驗室保存的盾纖毛蟲液體，10倍梯度稀釋后挑含I個纖毛蟲的液滴立即轉(zhuǎn)移到Iml魚湯培養(yǎng)基中置于14-18?培養(yǎng)，待魚湯培養(yǎng)基中盾纖毛蟲密度達到5X 13個/ml以上時，將該Iml魚湯培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到50ml魚湯培養(yǎng)基中置于14-18°C繼續(xù)培養(yǎng)，直至該50ml魚湯培養(yǎng)基中盾纖毛蟲密度達到5X 13個/ml以上，做為盾纖毛蟲培養(yǎng)液備用。
[0013]所述的步驟2中的魚湯培養(yǎng)基配法為:取50ml陳海水，經(jīng)過121°C，20min滅菌，冷卻后加入Iml魚肉湯母液。
[0014]上所述的魚肉湯母液配置方法為:取大菱鲆魚肉10-30g于錐形瓶中，加入50ml的蒸餾水，電爐煮沸1min冷卻，將上清液分裝至滅好菌的1.5ml的離心管中，每管分裝1ml，放置于一 20°C冰箱備用。
[0015]步驟3.殺蟲活性菌株篩選:將分離獲得的海洋細菌與盾纖毛蟲在96孔板中進行共培養(yǎng)。取一個96孔板，96孔板的A1、B1孔做空白對照，加160 μ I滅菌海水，其余孔為實驗組；取步驟⑴細菌菌液160 μ I加入到96孔板中，每種細菌設(shè)2個平行，即每一種細菌加兩孔；取步驟(2)獲得的盾纖毛蟲培養(yǎng)液，依次向96孔板加注了滅菌海水或細菌菌液的孔中再加注160 μ I盾纖毛蟲培養(yǎng)液，將加好樣的96孔板置于濕盒中，放到16°C共培養(yǎng)；監(jiān)測共培養(yǎng)體系中盾纖毛蟲的存活率確定殺蟲細菌。開始共培養(yǎng)后，每隔12小時，從培養(yǎng)箱中取出96孔板，將每孔液體吹勻后取出20 μ I液體在顯微鏡下觀察盾纖毛蟲生長情況和存活率，液體中觀察不到活躍的盾纖毛蟲或活躍的纖毛蟲個體少于I個，則細菌為有效菌。通過該步驟，有效細菌Bg-7被篩選出并留存。
[0016]所述的步驟3中細菌留存，其方法為，將Bg-7從保存?zhèn)溆闷矫笊咸羧尉涞絀毫升海水2216E液體培養(yǎng)基中置于25°C搖菌36-96小時，至其0D_達到0.4-0.6，加入滅菌的甘油，使甘油的終濃度為30-50%，-80°C保存?zhèn)溆谩?br>[0017]實施例2菌株Bg-7的鑒定與保藏
[0018]步驟1.菌株的生理生化分析:菌株Bg-7的生理生化鑒定參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》操作，鑒定結(jié)果為該菌為革蘭氏陰性菌，其接觸酶反應(yīng)為陽性，氧化酶反應(yīng)為陰性，在MA培養(yǎng)基(Difco，貨號:212185)上形成奶白色菌落，菌落為圓形，中間有微凸起，該菌利用檸檬酸鹽反應(yīng)為陽性，發(fā)酵七葉靈檸檬酸鐵、2-酮葡萄糖酸鉀、2-酮葡萄糖酸鉀、甘露醇、肌醇、葡萄糖產(chǎn)酸。
[0019]步驟2.菌株的16S rRNA基因的擴增與序列分析
[0020]16S rRNA基因模板的制備:從Bg-7保存?zhèn)溆闷矫笊咸羧尉涞組A 2216培養(yǎng)