一種高效生產(chǎn)γ-氨基丁酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種高效生產(chǎn)Y-氨基丁酸的方法，尤其是利用一株分泌表達(dá)谷氨酸 脫羧酶的基因工程菌高效生產(chǎn)y-氨基丁酸的方法，屬于發(fā)酵工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] y_氨基丁酸（y-aminobutyricacid，簡(jiǎn)稱GABA)，又稱4-氨基丁酸、氨酪酸，是 一種在自然界中廣泛存在并具有重要的生理功能的非蛋白類氨基酸。在人體中GABA是中 樞神經(jīng)系統(tǒng)中三大抑制性神經(jīng)遞質(zhì)之一，具有緩解焦慮、降低血壓、安眠鎮(zhèn)定等生理功效， 因此在醫(yī)療保健方面應(yīng)用廣泛。發(fā)酵法生產(chǎn)GABA主要是利用微生物自身的谷氨酸脫羧酶 (glutamatedecarboxylase，GAD，EC4. 1. 1. 15)，催化谷氨酸或谷氨酸鈉發(fā)生脫羧反應(yīng)生 成Y-氨基丁酸。
[0003] 為實(shí)現(xiàn)Y_氨基丁酸的合成，需要添加一水合谷氨酸鈉作為底物。谷氨酸脫羧酶 是一種胞內(nèi)酶，在大腸桿菌胞內(nèi)中過表達(dá)谷氨酸脫羧酶來生產(chǎn)y-氨基丁酸時(shí)，由于細(xì)胞 膜壁對(duì)底物和酶的分隔，導(dǎo)致Y-氨基丁酸產(chǎn)量及生產(chǎn)效率的降低。此外，胞內(nèi)表達(dá)的谷氨 酸脫羧酶在大批量分離純化方面也有諸多困難。因此，實(shí)現(xiàn)谷氨酸脫羧酶的胞外表達(dá)將有 利于提升y-氨基丁酸生產(chǎn)效率以及谷氨酸脫羧酶的獲得。
[0004] 在細(xì)菌中，大多數(shù)分泌蛋白都是通過Sec系統(tǒng)以未折疊的形式被轉(zhuǎn)運(yùn)到周質(zhì)空間 中，再在周質(zhì)空間中進(jìn)行折疊。而谷氨酸脫羧酶是一個(gè)同源六聚體蛋白，實(shí)驗(yàn)室此前研宄顯 示，Sec系統(tǒng)信號(hào)肽PelB不能在胞外分泌有活性的谷氨酸脫羧酶，可能是由于在周質(zhì)空間 中的正確折疊難以有效進(jìn)行。
[0005] 除了Sec系統(tǒng)，還有少量蛋白通過雙精氨酸系統(tǒng)轉(zhuǎn)送到胞外。雙精氨酸系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn) 胞內(nèi)已經(jīng)折疊好的蛋白，以此，對(duì)于不能在細(xì)胞質(zhì)以外的環(huán)境中正確折疊的蛋白，雙精氨酸 信號(hào)肽是一個(gè)良好的選擇。該系統(tǒng)包括具有轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能力的轉(zhuǎn)運(yùn)通道復(fù)合體TatA和能夠 特異性識(shí)別的雙精氨酸信號(hào)肽的信號(hào)識(shí)別復(fù)合體TatBC。
[0006] 本發(fā)明用雙精氨酸信號(hào)肽TorA對(duì)E.coliW3110來源的谷氨酸脫羧酶（GadB)在 E.coliBL21(DE3)進(jìn)行分泌表達(dá)。并在發(fā)酵罐水平進(jìn)行了GABA的生產(chǎn)，6h內(nèi)GABA產(chǎn)量可 達(dá)203g/L。此外，谷氨酸脫羧酶的胞外表達(dá)對(duì)降低其分離純化的成本將產(chǎn)生積極的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明提供了首先提供了一種分泌表達(dá)谷氨酸脫羧酶的大腸桿菌基因工程菌，所 述基因工程菌是以雙精氨酸信號(hào)肽TorA分泌谷氨酸脫羧酶。
[0008] 編碼所述雙精氨酸信號(hào)肽TorA的基因來自大腸桿菌基因組。
[0009] 編碼所述谷氨酸脫羧酶的基因來自大腸桿菌基因組。
[0010] 本發(fā)明還提供一種構(gòu)建所述大腸桿菌基因工程菌的方法，是以大腸桿菌E.coli w3110基因組DNA作模板，PCR獲得信號(hào)肽torA基因和谷氨酸脫羧酶的基因gadB;用限制 性內(nèi)切酶分別消化處理torA基因和gadB基因的PCR產(chǎn)物，酶切產(chǎn)物純化后，連接載體并轉(zhuǎn) 化E.coliBL21 (DE3)，獲得分泌表達(dá)谷氨酸脫羧酶的大腸桿菌基因工程菌。
[0011] 本發(fā)明還提供一種應(yīng)用所述大腸桿菌基因工程菌產(chǎn)谷氨酸脫羧酶的方法，是將 37°C、200rpm下過夜培養(yǎng)的種子以5%的接種量轉(zhuǎn)入TB培養(yǎng)基，于37°C、200rpm條件下培 養(yǎng)，〇D6(J直為1. 0時(shí)，添加終濃度為0. 7mM的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。
[0012] 本發(fā)明還提供了另一種應(yīng)用所述大腸桿菌基因工程菌產(chǎn)谷氨酸脫羧酶的方法，是 將種子培養(yǎng)液以5-10%的接種量轉(zhuǎn)入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐，于37°C、200rpm條件下培 養(yǎng)；待培養(yǎng)基中初始甘油消耗盡，即發(fā)酵罐中溶氧上升時(shí)，以比生長(zhǎng)速率〇. 12-0. 201T1指數(shù) 流加補(bǔ)料培養(yǎng)基，通過攪拌轉(zhuǎn)速與溶氧偶聯(lián)控制溶氧約30%;待0D_達(dá)到40-50,補(bǔ)料培養(yǎng) 基由指數(shù)流加轉(zhuǎn)為恒速流加，流加速率12mL/h，并開始以0. 8g/L/h的速度流加200g/L的乳 糖進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)12-24h。
[0013] 種子培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基（1L):胰蛋白胨10g，酵母抽提物5g，NaCllOg，pH調(diào)至 7. 0〇
[0014]TB培養(yǎng)基（1L):胰蛋白胨12g，酵母抽提物24g，甘油5g， K2HP0414. 6g，NaH2P04 ? 2H203. 6g，甘氨酸 7. 5g，NaC15g〇
[0015] 發(fā)酵培養(yǎng)基（1L):胰蛋白胨30g，酵母抽提物20g，甘油8g， Na2S042. 0g，（NH4)2S042. 5g，（NH4)2-H-citratel. 0g，K2HP04 14. 6g，NaH2P04 ? 2H203. 6g， MgS04 ? 7H202. 0g，維生素B1 100mg。
[0016] 補(bǔ)料培養(yǎng)基（1L):酵母膏50g，酵母膏50g，甘油500g，MgS04 ? 7H203. 4g。
[0017] 本發(fā)明還提供了一種應(yīng)用所述大腸桿菌基因工程菌高效合成Y-氨基丁酸的 方法，在3L發(fā)酵罐培養(yǎng)所述基因工程菌到發(fā)酵液中積累谷氨酸脫羧酶后，調(diào)整溫度為 37-50°〇,50-100%磷酸控制口114.6-5.0，分批次加入總量400-60(^/1的一水合谷氨酸鈉， 轉(zhuǎn)化6h。
[0018] 本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了谷氨酸脫羧酶的分泌表達(dá)，有利于簡(jiǎn)化酶的分離純化程序，降低分 離純化成本。且本發(fā)明涉及的大腸桿菌基因工程菌經(jīng)培養(yǎng)誘導(dǎo)產(chǎn)谷氨酸脫羧酶后，可直接 利用發(fā)酵體系中的一水合谷氨酸鈉高效合成GABA，6h內(nèi)其GABA產(chǎn)量達(dá)203. 7g/L。
【附圖說明】
[0019] 圖1重組菌的谷氨酸脫羧酶SDS-PAGE，1、2為空載的胞內(nèi)和胞外；3、4為重組菌的 胞內(nèi)和胞外。
[0020] 圖2重組菌發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸脫羧酶轉(zhuǎn)化生產(chǎn)GABA的過程曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 實(shí)施例1重組菌的構(gòu)建
[0022] 1)從大腸桿菌E.coliW3110提取基因組DNA作模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增信號(hào)肽 torA基因的引物為：5' -CGCCATATGATGAACAATAACGATCTCTTTCAGGC-3' 和 5'-CATCCATGGCCG CTTGCGCCGCAGTC-3'，擴(kuò)增谷氨酸脫羧酶基因gadB的引物為:5'-CATCCATGGATAAGAAGCAAGT AACG-3' 和 5' -CCCTCGAGTCAGGTATGTTTAAAGCTGTT-3' 〇
[0023] 2)用限制性內(nèi)切酶Ndel和Ncol消化處理torA基因的PCR產(chǎn)物，用限制性內(nèi)切酶 Ncol和Xhol消化處理gadB基因的PCR產(chǎn)物，載體pET20b(+)用Ndel和Xhol處理。酶切 產(chǎn)物純化后，T4連接酶22攝氏度連接過夜，轉(zhuǎn)化E.coliJM109,篩選正確轉(zhuǎn)化子。對(duì)于得 到的正確轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)
[0024] 實(shí)施例2搖瓶水平重組菌的胞外谷氨酸脫羧酶SDS-PAGE和谷氨酸脫羧酶酶活檢 測(cè)
[0025] 1)重組菌搖瓶水平發(fā)酵
[0026] a)培養(yǎng)基：種子培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基（1L):胰蛋白胨10g，酵