一種皮膚纖維母細(xì)胞的培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及干細(xì)胞領(lǐng)域，具體涉及一種纖維母細(xì)胞的培養(yǎng)方法，尤其是一種皮膚纖維母細(xì)胞的培養(yǎng)方法
【背景技術(shù)】
[0002]纖維母細(xì)胞，也稱為成纖維細(xì)胞，是真皮組織的主要組成成分，屬于終末分化細(xì)胞，是疏松結(jié)締組織的主要細(xì)胞成分，纖維母細(xì)胞數(shù)目最多，胞體大，為多突的紡錘形或星形的扁平細(xì)胞，細(xì)胞核呈規(guī)則的卵圓形，細(xì)胞輪廓不清，具有突起。其形態(tài)尚可依細(xì)胞的功能變化及其附著處的物理性狀不同而發(fā)生改變。這種細(xì)胞會生產(chǎn)膠原蛋白等蛋白質(zhì)，在構(gòu)建人工皮膚和組織創(chuàng)傷修復(fù)中發(fā)揮著重要作用。
[0003]目前纖維母細(xì)胞主要是用于研宄細(xì)胞的老化、各種外來因子對細(xì)胞的損傷、細(xì)胞在體外條件下的惡性轉(zhuǎn)化、以及某些先天性代謝異常、酶缺陷等。由于皮膚纖維母細(xì)胞易于獲取，又易于在體外生長，皮膚纖維母細(xì)胞培養(yǎng)已在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)研宄中得到較廣泛的運(yùn)用。
[0004]對于纖維母細(xì)胞的獲取，目前已有的原代分離方法主要有兩種:⑴酶消化法，用胰蛋白酶或膠原酶對用含雙抗PBS漂洗干凈并剪碎的皮膚組織進(jìn)行消化，直至細(xì)胞分離出來，過200篩，離心、重懸、計數(shù)細(xì)胞密度并接種培養(yǎng)。(2)組織塊貼壁法，分別用含雙抗的PBS和75%乙醇漂洗干凈皮膚組織，眼科剪把皮膚組織剪碎成Imm3組織塊，用培養(yǎng)基接種于6孔板中進(jìn)行培養(yǎng)。
[0005]然而酶消化法，雖然能在短時間內(nèi)獲得數(shù)量較多的細(xì)胞，但是胰蛋白酶或膠原酶本身對細(xì)胞的貼壁有一定的影響，貼壁率低。此外，多次酶消化法過程中多次進(jìn)行離心操作，而離心也對細(xì)胞造成一定的機(jī)械損傷。而組織塊貼壁法相對酶解法步驟較為簡單，但是周期長，貼壁穩(wěn)定性低，細(xì)胞爬出率低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]有鑒于此，本發(fā)明目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，提供一種皮膚纖維母細(xì)胞的培養(yǎng)方法，本發(fā)明所述培養(yǎng)方法不僅可以縮短爬片周期，提高細(xì)胞貼壁率和貼壁效果，而且使真皮層和表皮層最大限度的分離開，避免表皮細(xì)胞過多的影響纖維母細(xì)胞的生長。
[0007]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
[0008]一種皮膚纖維母細(xì)胞的培養(yǎng)方法，皮膚預(yù)處理后加入胰蛋白酶，4°C消化后去除表皮，剪碎后置于離心管中加入含雙抗的PBS，離心棄掉漂浮的組織塊及上清，用完全培養(yǎng)基重懸沉淀的組織塊，添加雙抗，37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，隨后進(jìn)行換液和傳代處理直至第10代。
[0009]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述培養(yǎng)方法中所述皮膚為小鼠腹部皮膚。
[0010]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述培養(yǎng)方法中所述預(yù)處理為皮膚除毛清洗后去除皮下組織和毛細(xì)血管。
[0011]其中，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述培養(yǎng)方法中所述除毛具體為剪刀把毛剪掉后用脫毛膏脫毛，以更好的除凈毛發(fā)，避免毛發(fā)影響組織塊貼壁。
[0012]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述培養(yǎng)方法中所述清洗為PBS清洗后用含雙抗的PBS清洗。所述清洗的次數(shù)為2-3次。
[0013]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述培養(yǎng)方法中所述胰蛋白酶濃度為0.1%。
[0014]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述培養(yǎng)方法中所述消化時間為12-16小時。
[0015]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述培養(yǎng)方法中所述去除表皮具體為消化后的皮膚加入含雙抗的PBS中刮去表皮。本發(fā)明所述培養(yǎng)方法經(jīng)酶解消化后表皮角質(zhì)層軟化，對比單純組織塊貼壁法，用細(xì)胞刮能輕松刮下表皮層，可有效降低表皮層對真皮層貼壁的影響。
[0016]在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明所述培養(yǎng)方法中在去除表皮后還包括用含雙抗的PBS清洗的步驟，以去除殘留的胰蛋白酶和表皮層。
[0017]其中，本發(fā)明所述含雙抗的PBS為含青霉素和鏈霉素的磷酸鹽緩沖液。所述含雙抗的PBS為含青霉素和鏈霉素的磷酸鹽緩沖液。所述雙抗的濃度為I %，即青霉素工作濃度為100U/mL，鏈霉素工作濃度為0.lmg/mL。
[0018]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述培養(yǎng)方法中所述添加雙抗為添加青霉素-鏈霉素溶液。其中青霉素工作濃度為100U/mL，鏈霉素工作濃度為0.lmg/mL。
[0019]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述培養(yǎng)方法中所述離心為低速離心。
[0020]在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述離心為為lOOOrpm，離心3min。
[0021]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述培養(yǎng)方法中所述完全培養(yǎng)基為高糖DMEM+10%FBS0
[0022]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述培養(yǎng)方法中所述培養(yǎng)以經(jīng)明膠處理細(xì)胞培養(yǎng)板為載體。
[0023]在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述明膠處理具體為細(xì)胞培養(yǎng)板中加入0.1 %明膠，孵育30min，回收明膠。
[0024]在一個具體實(shí)施例中，以現(xiàn)有的組織塊貼壁法作為對比例，觀察本發(fā)明所述培養(yǎng)方法培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)。結(jié)果顯示，本發(fā)明所述培養(yǎng)方法細(xì)胞接種培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)大部分組織塊2天后緊貼6孔板，3天后鏡下可見高密度的類圓形細(xì)胞爬出，7天后可見爬出細(xì)胞較多。本發(fā)明所述培養(yǎng)方法細(xì)胞爬出速度和爬出數(shù)量要優(yōu)于單純的組織塊貼壁法。
[0025]在一個具體實(shí)施例中，對本發(fā)明所述培養(yǎng)方法培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行HE染色鑒定。結(jié)果顯示大部分細(xì)胞為長梭型，為典型的成纖維細(xì)胞形態(tài)，聚集生長，細(xì)胞核較為明顯，細(xì)胞輪廓不是很清晰。
[0026]進(jìn)一步的，在一個具體實(shí)施例中，對本發(fā)明所述培養(yǎng)方法培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行流式鑒定。結(jié)果顯示波形蛋白抗體(Vimentin)的表達(dá)率為97.9%，高于95%，而角蛋白抗體(CK15抗體)的表達(dá)率為2.6%，低于5%，表明采用本發(fā)明所述培養(yǎng)方法培養(yǎng)的細(xì)胞具有皮膚纖維母細(xì)胞特性。
[0027]本發(fā)明所述皮膚纖維母細(xì)胞的培養(yǎng)方法，皮膚預(yù)處理后加入胰蛋白酶，4°C消化后去除表皮，剪碎后置于離心管中加入含雙抗的PBS，離心棄掉漂浮的組織塊及上清，用完全培養(yǎng)基重懸沉淀的組織塊，添加雙抗，37°C、5% C02培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，隨后進(jìn)行換液和傳代處理直至第10代。本發(fā)明所述培養(yǎng)方法操作簡單、安全有效。實(shí)驗(yàn)表明，與現(xiàn)有方法相比，本發(fā)明所述皮膚纖維母細(xì)胞的培養(yǎng)方法能夠縮短細(xì)胞爬片時間，而且能夠獲得更多的細(xì)胞量且能很好保持皮膚纖維母細(xì)胞的形態(tài)和良好的細(xì)胞特性，適用于皮膚纖維母細(xì)胞的大量培養(yǎng)。
【附圖說明】
[0028]為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。
[0029]圖1示實(shí)施例2培養(yǎng)的細(xì)胞狀態(tài)圖，放大倍數(shù)均為100倍；其中圖a和圖b為實(shí)施例I所述方法培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)圖，圖a為培養(yǎng)3天，圖b為培養(yǎng)7天；圖c和圖d為組織塊貼壁法培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)圖，圖c為培養(yǎng)5天，圖d為培養(yǎng)7天；
[0030]圖2示實(shí)施例3皮膚纖維母細(xì)胞的HE染色鑒定結(jié)果圖，放大倍數(shù)均為100倍；
[0031]圖3示實(shí)施例4皮膚纖維母細(xì)胞的流式鑒定結(jié)果圖，其中圖a為波形蛋白抗體(Vimentin)表達(dá)情況圖，圖b為角蛋白抗體(CK15抗體)表達(dá)情況圖。
【具體