一種誘導(dǎo)多能干細(xì)胞培養(yǎng)基、應(yīng)用及培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種誘導(dǎo)多能干細(xì)胞培養(yǎng)基、應(yīng)用及培養(yǎng)方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（inducedpluripotentstemcells,iPScells)最初是日本人 山中申彌（ShinyaYamanaka)于2006年利用病毒載體將四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子（0ct4，Sox2，Klf4 和c-Myc)的組合轉(zhuǎn)入分化的體細(xì)胞中，使其重編程而得到的類似胚胎干細(xì)胞的一種細(xì)胞 類型。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞能夠通過(guò)向體細(xì)胞中導(dǎo)入誘導(dǎo)基因，使體細(xì)胞重編程獲得具有胚胎 干細(xì)胞樣特性的多能干細(xì)胞，也稱為去分化。
[0003] 隨后世界各地不同科學(xué)家陸續(xù)發(fā)現(xiàn)其他方法同樣也可以制造這種細(xì)胞。成功建立 iPS細(xì)胞后，應(yīng)用iPS細(xì)胞來(lái)治療疾病是人們的最終目標(biāo)。iPS細(xì)胞不僅可用于分化和移 植，還可以提供體外的疾病模型，以便于研宄疾病形成的機(jī)制、篩選新藥以及開發(fā)新的治療 方法。人類iPS細(xì)胞的建立被公認(rèn)為2007年最重要的科技進(jìn)展之一，這項(xiàng)技術(shù)不僅可以 從體細(xì)胞建立個(gè)體特異的多能干細(xì)胞系，解決了細(xì)胞移植治療中的免疫排斥問(wèn)題，而且為 研宄人類細(xì)胞的重編程的機(jī)理以及研宄個(gè)體特異的疾病發(fā)生機(jī)理提供了有力的方法。在干 細(xì)胞研宄領(lǐng)域，iPS細(xì)胞技術(shù)的出現(xiàn)無(wú)疑是具有里程碑意義的突破，多種體細(xì)胞經(jīng)過(guò)體外 培養(yǎng)和誘導(dǎo)均可轉(zhuǎn)變成為具有多向分化潛能的干細(xì)胞，并且證明了幾種已知的轉(zhuǎn)錄因子 可以使已分化的體細(xì)胞逆轉(zhuǎn)為未分化的狀態(tài)，表明細(xì)胞的巨大可塑性。
[0004] 在體外，iPS細(xì)胞可定向誘導(dǎo)分化出多種細(xì)胞，比如神經(jīng)干細(xì)胞、肝臟干細(xì)胞、心 肌干細(xì)胞等，因此，iPS細(xì)胞在理論研宄和臨床應(yīng)用等方面都極具應(yīng)用價(jià)值。
[0005]目前IPS細(xì)胞的培養(yǎng)多采用含有胎牛血清（FBS)的培養(yǎng)基，比如DMEM/F12+20%FBS，但是FBS源于動(dòng)物，可能含有動(dòng)物源性病原體，這降低了IPS細(xì)胞在臨床上的應(yīng)用價(jià)值 和安全性。雖然有少數(shù)廠家開發(fā)了無(wú)血清的IPS細(xì)胞培養(yǎng)基，但這種培養(yǎng)基培養(yǎng)的IPS細(xì) 胞增殖速度較慢。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006] 本發(fā)明解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種誘導(dǎo)多能干細(xì)胞培養(yǎng)基、應(yīng)用及培養(yǎng)方法， 本發(fā)明的培養(yǎng)基中不含有動(dòng)物源性病原體，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞在該培養(yǎng)基中增殖速度快，提 高了安全性及應(yīng)用價(jià)值。
[0007] 本發(fā)明公開了一種誘導(dǎo)多能干細(xì)胞培養(yǎng)基，以頂DM/F12為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，每500mL IMDM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基中包括以下濃度的組分：
[0008]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種誘導(dǎo)多能干細(xì)胞培養(yǎng)基，以頂DM/F12為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，每500mL IMDM/F12基礎(chǔ)培 養(yǎng)基中包括以下濃度的組分： 重組人肢島素 0.1~I Omg/mL; 重組轉(zhuǎn)鐵蛋白 0.25~25ug/mL; 維生素 C 1.61~161ug/mL; 人白蛋白 0.1~10mg/mL; bFGF 1~1 OOng/mL; PDGF-bb 1~100ng/mL; EGF 1~100ng/mL; IGF-I 卜 100ng/mL; TGF-β 1~100ng/mL; 纖維連接蛋白 1~100ng/mL; Fetuin 0· 1 ~I Omg/mL; Betacellulin 1 ~100ug/mL; β-mercaptoethanol I O-1000 uM ; Thiazovivin I ~100ng/mL。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，每500mL IMDM/F12基 礎(chǔ)培養(yǎng)基中包括以下濃度的組分： 重組人腺島素 1~5mg/mL; 重組轉(zhuǎn)鐵蛋白 丨~20ug/mL; 維生素 C 5~100ug/mL; 人白蛋白 丨~5 m g/mL; bFGF 5~80ng/mL; PDGF-bb 10~80ng/mL; EGF 10~80ng/mL; IGF-1 5 ~80ng/mL; TGF-β 10 ~80ng/mL; 纖維連接蛋白 10~80ng/mL; Fetuin 1 ~8mg/mL; Betacellulin 10 ~80ug/mL; β-mercaptoethanol 100~800uM ; Thiazovivin 5 ~80ng/mL。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，每500mL IMDM/F12基 礎(chǔ)培養(yǎng)基中包括以下濃度的組分： 重組人胰島素 lmg/mL; 重組轉(zhuǎn)鐵蛋白 2.5ug/mL; 維生素 C 16.1ug/mL; 人白蛋白 Img/mL; bFGF lOng/mL; PDGF-bb I Ong/mL; EGF lOng/mL; IGF-I lOng/mL; TGF-β I Ong/mL; 纖維連接蛋白 lOng/mL; Fetuin I mg/mL; Betacellulin I Oug/mL; β-mercaptoethanol 50uM ; Thiazovivin 10ng/mL〇
4. 權(quán)利要求1~3任意一項(xiàng)中所述的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的培養(yǎng)基在培養(yǎng)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 中的應(yīng)用。
5. -種誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，包括以下步驟： (A)重懸誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，獲得誘導(dǎo)多能干細(xì)胞懸液； (B)將誘導(dǎo)多能干細(xì)胞懸液加入權(quán)利要求1~3任意一項(xiàng)中所述的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞培 養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟（A)具體為： 用Accutase或IV膠原酶消化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞； 用權(quán)利要求所述的培養(yǎng)基重懸誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，得到誘導(dǎo)多能干細(xì)胞懸液。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種用于生物技術(shù)領(lǐng)域的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞培養(yǎng)基，其應(yīng)用及培養(yǎng)方法。以IMDM/F12為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，每500mL IMDM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基中包括以下濃度的組分：重組人胰島素，重組轉(zhuǎn)鐵蛋白，維生素C，人白蛋白，bFGF，PDGF-bb，EGF，IGF-1，TGF-β，纖維連接蛋白，F(xiàn)etuin，Betacellulin，β-mercaptoethanol，Thiazovivin。本發(fā)明的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞培養(yǎng)基中完全不采用動(dòng)物血清，從而有效避免了帶有動(dòng)物源性病院體的風(fēng)險(xiǎn)，提高了誘導(dǎo)多能干細(xì)胞在臨床上應(yīng)用的安全性。本發(fā)明的培養(yǎng)基可以使誘導(dǎo)多能干細(xì)胞增殖速度快，在臨床上具有很大的應(yīng)用價(jià)值。
【IPC分類】C12N5-0735
【公開號(hào)】CN104830753
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510260848
【發(fā)明人】王一飛, 陳海佳, 葛嘯虎, 盧瑞珊, 王小燕, 李平
【申請(qǐng)人】廣州賽萊拉干細(xì)胞科技股份有限公司
【公開日】2015年8月12日
【申請(qǐng)日】2015年5月20日