一種大鼠心肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種大鼠心肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]在心肌細(xì)胞生長發(fā)育、生理、代謝、病理等研宄中具有重要作用。因此，心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于心血管疾病機(jī)理及心血管藥物和心臟組織工程學(xué)的研宄。目前本領(lǐng)域常見的心肌細(xì)胞培養(yǎng)方法有:1.采用乳鼠四肢固定在操作面板上，取心臟這樣的話手術(shù)開口大，出血多，心肌細(xì)胞中容易混入大量的血細(xì)胞。2.采用10%FCS/DMEM(高糖)培養(yǎng)心肌細(xì)胞，此培養(yǎng)基同樣適宜心肌成纖維細(xì)胞生長，所以得到的心肌細(xì)胞純度低。3.傳統(tǒng)方法培養(yǎng)的心肌細(xì)胞達(dá)到同步收縮的時(shí)間較長，一般至少3天，不能很好的滿足實(shí)驗(yàn)要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]根據(jù)上述所列舉的問題，本發(fā)明提供了一種大鼠心肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，具有分離培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞存活率高，心肌細(xì)胞和非心肌細(xì)胞分離較徹底，細(xì)胞貼壁快、純度高、節(jié)律性的同步收縮時(shí)間早、且操作簡便、重復(fù)性好，是一種較為理想的心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)方法；可以滿足心血管疾病發(fā)生、發(fā)展機(jī)理及心血管藥物和心臟組織工程學(xué)的研宄及多種生理生化實(shí)驗(yàn)的要求。
[0004]本發(fā)明提供下述技術(shù)方案解決上述技術(shù)問題。
[0005]本發(fā)明提供的技術(shù)方案是:一種大鼠心肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于:包括如下步驟:
[0006](I)把新生Sprague-Dawlcy (SD)大鼠(以下簡稱乳鼠)酒精噴拭消毒后置于四周與下層均鋪有紗布的無菌方盒中，以拭干小鼠身上多余的酒精；
[0007](2)左手握住乳鼠，將乳鼠仰臥固定后，碘伏消毒胸腹部并脫典，之后用右手用眼科鑷在上肢間略下處進(jìn)行用眼科手術(shù)剪“V” 口剪開，左手指手頂鼠脊柱使心臟暴露，心尖即刻蹦出，取另一無菌剪刀剪取心尖部，并將心尖載于有PBS液的培養(yǎng)皿中洗滌，充分去除血細(xì)胞；
[0008](3)將心尖組織移入抗生素小瓶中，并加入3ml的DMHM培養(yǎng)基，用眼科剪將大鼠心肌組織剪成IXlmm2的組織塊，吸棄培養(yǎng)基；加入3ml 0.125%的胰蛋白酶，左手握住抗生素瓶瓶壁，以保持37°C胰酶最佳消化溫度；右手拿彎頭吸管吹打lmin，消化液變渾濁后移出消化液并用10% FCS/DMEM中和，未消化組織在抗生素瓶中，重新加入胰酶，如此上方法消化3次并中和；
[0009](4)將細(xì)胞懸液過200目篩后，1200rpm/min離心5min，棄上清，細(xì)胞沉淀用5%FCS/CMM培養(yǎng)基重懸，細(xì)胞懸液接種6孔板I塊，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0010](5)細(xì)胞貼壁90min后，吸取未貼壁的心肌細(xì)胞懸液，顯微鏡觀察，鏡下可見心肌細(xì)胞80-90%融合，并具有較強(qiáng)的自發(fā)節(jié)律性和收縮性特征。
[0011]其中，步驟⑴所述的Sprague-Dawlcy(SD)大鼠是取自新出生1-3天的，并且雌雄不分。
[0012]其中，步驟(2)所述的將心尖載于有PBS液的培養(yǎng)皿中洗滌，洗滌次數(shù)為3次，每次 Imin0
[0013]其中，步驟⑵所述的PBS液已4°C預(yù)冷；培養(yǎng)皿置于冰上。
[0014]其中，步驟(5)吸取未貼壁的心肌細(xì)胞懸液需要接種6孔板I塊，每孔5X105個(gè)/mL細(xì)胞，24h更換培養(yǎng)基。
[0015]本發(fā)明所實(shí)現(xiàn)的有益效果:本發(fā)明取材方便，大鼠不分雌雄，在培養(yǎng)過程中方法簡單、操作性強(qiáng)，體外心肌細(xì)胞分離、培養(yǎng)的方法成本低、耗時(shí)短、程序簡化；手術(shù)開口小，出血少，避免大量血細(xì)胞污染；使用心肌細(xì)胞專用培養(yǎng)基(Cardiac Myocyte Medium,sciencelDCMM，得到大量的純度更高的心肌細(xì)胞，從而保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)的使用，且分離培養(yǎng)得到的心肌細(xì)胞具有自發(fā)節(jié)律性和收縮性特征，能夠保持其在體內(nèi)原有的許多結(jié)構(gòu)和功會(huì)K。
【具體實(shí)施方式】
[0016]下面通過實(shí)施例的方式進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施例范圍之中。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說明書選擇。本發(fā)明所用試劑和原料均為公知的技術(shù)，在本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員所熟知的技術(shù)，而且在市場上很容易購得。
[0017]本發(fā)明提供了一種大鼠心肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，具有分離培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞存活率高，心肌細(xì)胞和非心肌細(xì)胞分離較徹底，細(xì)胞貼壁快、純度高、節(jié)律性的同步收縮時(shí)間早、且操作簡便、重復(fù)性好，是一種較為理想的心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)方法:可以滿足心血管疾病發(fā)生、發(fā)展機(jī)理及心血管藥物和心臟組織工程學(xué)的研宄及多種生理生化實(shí)驗(yàn)的要求。
[0018]本發(fā)明提供的技術(shù)方案之一是:一種大鼠心肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，包括如下步驟:
[0019](I)把新生Sprague-Dawlcy (SD)大鼠(以下簡稱乳鼠)酒精噴拭消毒后置于四周與下層均鋪有紗布的無菌方盒中，以拭干小鼠身上多余的酒精；
[0020](2)左手握住乳鼠，將乳鼠仰臥固定后，碘伏消毒胸腹部并脫典，之后用右手用眼科鑷在上肢間略下處進(jìn)行用眼科手術(shù)剪“V” 口剪開，左手指手頂鼠脊柱使心臟暴露，心尖即刻蹦出，取另一無菌剪刀剪取心尖部，并將心尖載于有PBS液的培養(yǎng)皿中洗滌，充分去除血細(xì)胞；
[0021](3)將心尖組織移入抗生素小瓶中，并加入3ml的DMHM培養(yǎng)基，用眼科剪將大鼠心肌組織剪成IXlmm2的組織塊，吸棄培養(yǎng)基；加入3ml 0.125%的胰蛋白酶，左手握住抗生素瓶瓶壁，以保持37°C胰酶最佳消化溫度；右手拿彎頭吸管吹打lmin，消化液變渾濁后移出消化液并用10% FCS/DMEM中和，未消化組織在抗生素瓶中，重新加入胰酶，如此上方法消化3次并中和；
[0022](4)將細(xì)胞懸液過200目篩后，1200rpm/min離心5min，棄上清，細(xì)胞沉淀用5%FCS/CMM培養(yǎng)基重懸，細(xì)胞懸液接種6孔板I塊，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0023](5)細(xì)胞貼壁90min后，吸取未貼壁的心肌細(xì)胞懸液，顯微鏡觀察，鏡下可見心肌細(xì)胞80-90%融合，并具有較強(qiáng)的自發(fā)節(jié)律性和收縮性特征。
[0024]其中，步驟⑴所述的Sprague-Dawlcy(SD)大鼠是取自新出生1-3天的，并且雌雄不分。
[0025]其中，步驟(2)所述的將心尖載于有PBS液的培養(yǎng)皿中洗滌，洗滌次數(shù)為3次，每次 Imin0
[0026]其中，步驟⑵所述的PBS液已4°C預(yù)冷；培養(yǎng)皿置于冰上。
[0027]其中，步驟(5)吸取未貼壁的心肌細(xì)胞懸液需要接種6孔板I ±夬，每孔5X105個(gè)/mL細(xì)胞，24h更換培養(yǎng)基。
[0028]本發(fā)明所實(shí)現(xiàn)的有益效果:本發(fā)明取材方便，大鼠不分雌雄，在培養(yǎng)過程中方法簡單、操作性強(qiáng)，體外心肌細(xì)胞分離、培養(yǎng)的方法成本低、耗時(shí)短、程序簡化；手術(shù)開口小，出血少，避免大量血細(xì)胞污染；使用心肌細(xì)胞專用培養(yǎng)基(Cardiac Myocyte Medium,sciencelDCMM，得到大量的純度更高的心肌細(xì)胞，從而保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)的使用，且分離培養(yǎng)得到的心肌細(xì)胞具有自發(fā)節(jié)律性和收縮性特征，能夠保持其在體內(nèi)原有的許多結(jié)構(gòu)和功會(huì)K。
[0029]以上所記載，僅為利用本創(chuàng)作技術(shù)內(nèi)容的實(shí)施例，任何熟悉本項(xiàng)技藝者運(yùn)用本創(chuàng)作所做的修飾、變化，皆屬本創(chuàng)作主張的專利范圍，而不限于實(shí)施例所揭示者。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種大鼠心肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于:包括如下步驟: (1)把新生Sprague-Dawlcy(SD)大鼠(以下簡稱乳鼠)酒精噴拭消毒后置于四周與下層均鋪有紗布的無菌方盒中，以拭干小鼠身上多余的酒精； (2)左手握住乳鼠，將乳鼠仰臥固定后，碘伏消毒胸腹部并脫典，之后用右手用眼科鑷在上肢間略下處進(jìn)行用眼科手術(shù)剪“V” 口剪開，左手指手頂鼠脊柱使心臟暴露，心尖即刻蹦出，取另一無菌剪刀剪取心尖部，并將心尖載于有PBS液的培養(yǎng)皿中洗滌，充分去除血細(xì)胞； (3)將心尖組織移入抗生素小瓶中，并加入3ml的DMEM培養(yǎng)基，用眼科剪將乳鼠心肌組織剪成IXlmm2的組織塊，吸棄培養(yǎng)基；加入3ml 0.125%的胰蛋白酶，左手握住抗生素瓶瓶壁，以保持37°C胰酶最佳消化溫度；右手拿彎頭吸管吹打lmin，消化液變渾濁后移出消化液并用10% FCS/DMEM中和，未消化組織在抗生素瓶中，重新加入胰酶，如此上方法消化3次并中和； (4)將細(xì)胞懸液過200目篩后，1200rpm/min離心5min，棄上清，細(xì)胞沉淀用5%FCS/CMM培養(yǎng)基重懸，細(xì)胞懸液接種6孔板I塊，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； (5)細(xì)胞貼壁90min后，吸取未貼壁的心肌細(xì)胞懸液，顯微鏡觀察，鏡下可見心肌細(xì)胞80-90%融合，并具有較強(qiáng)的自發(fā)節(jié)律性和收縮性特征。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種大鼠心肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟(I)所述的Sprague-Dawlcy(SD)大鼠是取自新出生1-3天的，并且雌雄不分。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種大鼠心肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟(2)所述的將心尖載于有PBS液的培養(yǎng)皿中洗滌，洗滌次數(shù)為3次，每次lmin。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的一種大鼠心肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟(2)所述的PBS液已4°C預(yù)冷；培養(yǎng)皿置于冰上。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種大鼠心肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟(5)吸取未貼壁的心肌細(xì)胞懸液需要接種6孔板I塊，每孔5X105個(gè)/mL細(xì)胞，24h更換培養(yǎng)基。
【專利摘要】本發(fā)明公開一種大鼠心肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，采用本方法分離培養(yǎng)的心肌細(xì)胞存活率高，心肌細(xì)胞和非心肌細(xì)胞分離較徹底，細(xì)胞貼壁快、純度高，節(jié)律性的同步收縮時(shí)間早，且操作簡便、重復(fù)性好，是一種較為理想的心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)方法。可以滿足心血管疾病發(fā)生、發(fā)展機(jī)理及心血管藥物和心臟組織工程學(xué)的研究及多種生理生化實(shí)驗(yàn)的要求。
【IPC分類】C12N5-077
【公開號】CN104830759
【申請?zhí)枴緾N201510221469
【發(fā)明人】蔡維霞, 胡大海, 朱雄翔, 韓軍濤, 鄭朝, 官浩, 楊薛康, 王耘川, 計(jì)鵬
【申請人】中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)
【公開日】2015年8月12日
【申請日】2015年5月5日