Y-27632在間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用及間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及干細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域，尤其涉及Y-27632在間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用及 間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] ROCK信號(hào)通路抑制劑Y-27632的CASNO.為146986-50-7，分子式為 C14H21N30 ?HC1，相對(duì)分子量為320. 3,是一種高效的Rho相關(guān)的卷曲蛋白形成絲氨酸-蘇 氨酸蛋白激酶（ROCK)家族的小分子特異性抑制劑，能選擇性的抑制R0CKl(pl60R0CK)和 R0CK2,IC5(I (半數(shù)有效濃度）值分別為140nmol和800nmol;并且，Y-27632也抑制PRK2,其 IC5(I為600nmol/L。其抑制作用是通過與ATP競爭結(jié)合催化位點(diǎn)來實(shí)現(xiàn)的.現(xiàn)有技術(shù)表明， Y-27632的功能主要包括以下幾個(gè)方面：1、選擇性的抑制平滑肌鈣離子敏感性并阻斷其收 縮，阻止Rho誘導(dǎo)的、pl60R0CK介導(dǎo)的細(xì)胞張力纖維的形成；2、降低幾種高血壓大鼠模型的 血壓；3、保護(hù)艾氏腹水癌小鼠免于腫瘤的形成；4、阻止肝癌肝內(nèi)轉(zhuǎn)移。
[0003] 人間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal Stem Cells, MSC)是具有明顯可塑性和多向分化 潛能的一種成體干細(xì)胞，在不同生長因子的調(diào)節(jié)下，可分化成來源于3個(gè)胚層的不同組織 細(xì)胞類型，如脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、肝樣細(xì)胞、心肌樣細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞和胰 島樣細(xì)胞等。除此，人間充質(zhì)干細(xì)胞不表達(dá)主要組織相容性II類抗原，微量表達(dá)主要組織 相容性I類抗原，免疫原性低，移植排斥作用小，而且具有免疫調(diào)節(jié)功效，移植后的人羊膜 間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的營養(yǎng)因子，具有促血管生成、促細(xì)胞生長、抗炎癥和抗纖維化等作用， 在干細(xì)胞治療、組織工程治療和再生醫(yī)學(xué)研宄應(yīng)用中具有重要意義。
[0004] 人間充質(zhì)干細(xì)胞存在于骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺等組織以及羊 水、臍帶血中。目前，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用最為廣泛。不同來源的干細(xì)胞的生物學(xué)特征 存在相似之處，例如，都成纖維樣形態(tài)生長，具有強(qiáng)大的體外擴(kuò)增能力，都能像不同的組織 分化。但是，不同來源的干細(xì)胞之間生物學(xué)特征還存在著差異：
[0005]骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow derived mesenchymal stem cell, BMMSC)志物 除表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物、整合素家族。
[0006]人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞（humanamnioticmes-enchymalstromalcells，hAMSC)，來 源于胎盤的羊膜組織的間質(zhì)層，形態(tài)學(xué)類似于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。hAMSC的表面標(biāo)志物除 表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物、整合素家族外，還表達(dá)胚胎干細(xì)胞類的表面標(biāo)志物，這些因 子的陽性表達(dá)說明hAMSC的增殖能力比MMSC要強(qiáng)。hAMSC不表達(dá)HLA-DR、⑶14,弱表達(dá) HLA-ABC，且不表達(dá)共刺激銀子，⑶80、⑶83、⑶86、⑶40L，這表明hAMSC具有較低的免疫原 性。且研宄表明，hAMSC能表達(dá)多種比骨髓源MSC表達(dá)更豐富的造血細(xì)胞因子，例如：IL3細(xì) 胞因子。
[0007]人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cord mesnchymal stem cells，MSCs) 是指存在于新生兒臍帶組織中的一種多功能干細(xì)胞，增殖能力優(yōu)于骨髓MSCs，免疫原性比 骨髓MSCs低。研宄表明，分離后的臍帶血淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞百分比分別為60. 56 %和 17. 93%，明顯多于骨髓血46. 75%和10. 70%。分離后臍血干細(xì)胞的⑶34、⑶38明顯多于 骨髓血干細(xì)胞，分別為5. 7:1. 6和2. 4:1. 6。
[0008]目前對(duì)人MSC的培養(yǎng)基主要采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基（如DMEM/F12)聯(lián)合胎牛血清（FBS)， 但存在細(xì)胞增殖速度慢的特性。并且，異源血清的食用存在污染外源病毒和致病因子的風(fēng) 險(xiǎn)。因此，進(jìn)一步開發(fā)不采用異源血清而能保證細(xì)胞增殖速度和干性的培養(yǎng)方法十分必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供Y-27632在間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)中的 應(yīng)用及間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，本發(fā)明提供的方法不采用異源血清，而使用Y-27632促 進(jìn)MSC的增殖，從而實(shí)現(xiàn)在無血清條件下MSC的快速穩(wěn)定增殖，且能夠保持良好的干性。
[0010] 本發(fā)明提供了y-27632作為間充質(zhì)干細(xì)胞增殖促進(jìn)劑的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，相同培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)基中添加Y-27632能夠促進(jìn)間充質(zhì) 干細(xì)胞的增殖，實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)培養(yǎng)五代后，與未添加Y-27632的對(duì)照組相比，添加Y-27632的 實(shí)驗(yàn)組中，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量提高31. 87% ;羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量提高30%，骨 髓間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量提高27. 27%。
[0012] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，間充質(zhì)干細(xì)胞為人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、人臍帶間充質(zhì)干細(xì) 胞或人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0013] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，Y-27632作為間充質(zhì)干細(xì)胞增殖促進(jìn)劑的劑量為Ing/mL~ 100ng/mL〇
[0014] 在一些實(shí)施例中，Y-27632作為間充質(zhì)干細(xì)胞增殖促進(jìn)劑的劑量為10ng/mL。
[0015] 本發(fā)明提供的實(shí)施例表明，采用lg/mL~100g/mL的Y-27632作為間充質(zhì)干細(xì)胞 增殖促進(jìn)劑能夠很好的促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖，但當(dāng)濃度達(dá)到lOnmol/mL時(shí)，雖然仍能 起到促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，但細(xì)胞的干性出現(xiàn)下降。
[0016] 因此，本發(fā)明還提供了一種間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基，包括lonza完全培養(yǎng)基和 Y-27632 ;Y-27632 的濃度為Ing/mL~100ng/mL。
[0017] 在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基中Y-27632的濃度為 lOng/mLo
[0018]lonza完全培養(yǎng)基是一種一樣豐富的無血清培養(yǎng)基，其中以無血清培養(yǎng)基Lonza UltraCULTURETM為基質(zhì)，添加血清替代物PALLUltroserG。能夠給細(xì)胞提供豐富的營養(yǎng)， 使細(xì)胞快速、穩(wěn)定增長。
[0019] 本發(fā)明還提供了一種間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，包括：將原代間充質(zhì)干細(xì)胞接種 于本發(fā)明提供的培養(yǎng)基中，經(jīng)培養(yǎng)獲得P1代間充質(zhì)干細(xì)胞后傳代。
[0020] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，接種的密度為5000個(gè)/cm2。
[0021] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，培養(yǎng)的條件為37°C，5%C02,95%濕度。
[0022] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，培養(yǎng)的時(shí)間為3天。
[0023] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，傳代的次數(shù)為5次。
[0024] 經(jīng)傳代5次，細(xì)胞數(shù)量能夠達(dá)到1. 2X107。能夠滿足大部分常規(guī)實(shí)驗(yàn)的要求。若 仍需更大量的細(xì)胞數(shù)量，可進(jìn)一步傳代培養(yǎng)，通常經(jīng)傳代10代，細(xì)胞仍保持良好的干性及 旺盛的增殖能力。
[0025] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，間充質(zhì)干細(xì)胞為人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、人臍帶間充質(zhì)干細(xì) 胞或人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0026] 本發(fā)明提供了Y-27632作為間充質(zhì)干細(xì)胞增殖促進(jìn)劑的應(yīng)用。本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)證 實(shí)，相同培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)基中添加Y-27632能夠促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖，本發(fā)明還提供 了培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法，實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)培養(yǎng)五代后，與未添加Y-27632的 對(duì)照組相比，添加Y-27632的實(shí)驗(yàn)組中，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量提高31. 87%;羊膜間充 質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量提高30%，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量提高27. 27%。
【附圖說明】
[0027] 圖l_a示采用培養(yǎng)基1培養(yǎng)臍帶MSC5代后的的流式檢測圖；
[0028] 圖l_b示采用培養(yǎng)基3培養(yǎng)臍帶MSC5代后的的流式檢測圖；
[0029] 圖1-c示采用培養(yǎng)基1培養(yǎng)臍帶MSC10代的細(xì)胞增殖曲線；
[0030] 圖1-d示采用培養(yǎng)基1養(yǎng)臍帶MSC10代后的流式檢測圖；
[0031] 圖l_e示采用培養(yǎng)基1養(yǎng)臍帶MSC10代后的的流式檢測圖；
[0032] 圖2-a示采用培養(yǎng)基1培養(yǎng)羊膜MSC的流式檢測圖；
[0033] 圖2-b示采用培養(yǎng)基3培養(yǎng)羊膜MSC的流式檢測圖；
[0034] 圖3-a示采用培養(yǎng)基1培養(yǎng)骨髓MSC的流式檢測圖；
[0035] 圖3-b示采用培養(yǎng)基3培養(yǎng)骨髓MSC的流式檢測圖。
【具體實(shí)施方式】
[0036] 本發(fā)明提供了Y-27632在間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用及間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方 法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有 類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本 發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi) 容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明 技術(shù)。
[0037] 本發(fā)明采用的儀器皆為普通市售品，皆可于市場購得。
[0038]Y-28632 購自美國StemRD公司；
[0039]Y-28632用DMSO溶解，配成10yg/mL的保存液，置于4°C冰箱保存。
[0040] 培養(yǎng)基的配制：
[0041] 培養(yǎng)基 1 :lonza完全培養(yǎng)基 +Y-28632 (10ng/ml)
[0042] 培養(yǎng)基2 :lonza完全培養(yǎng)基
[0043]培養(yǎng)基 3: lonza完全培養(yǎng)基 +Y-28632(10nmol/ml)
[0044] 下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：
[0045] 實(shí)施例1
[0046] 以不同的培養(yǎng)基培養(yǎng)臍帶MSC，考察Y-28632對(duì)臍帶MSC的增殖促進(jìn)作用。方法：
[0047] 將P1代人臍帶MSC以5000個(gè)/cm2的密度種植于六孔板上，分別用培養(yǎng)基1~3 培養(yǎng)，每3天將細(xì)胞用0. 25%胰酶消化下來，計(jì)算細(xì)胞量，并以5000個(gè)/cm2的密度再次接 種培養(yǎng)，直至P5代，記錄每個(gè)代次的細(xì)胞收獲量，結(jié)果如表1。
[0048] 表1臍帶MSC數(shù)量
[0049]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. Y-27632作為間充質(zhì)干細(xì)胞增殖促進(jìn)劑的應(yīng)用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述間充質(zhì)干細(xì)胞為人骨髓間充質(zhì)干細(xì) 胞、人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞或人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述Υ-27632作為間充質(zhì)干細(xì)胞增殖促進(jìn) 劑的劑量為Ing/mL~100ng/mL。
4. 一種間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基，其特征在于，包括Ionza完全培養(yǎng)基和Y-27632 ;所述 Y-27632 的濃度為 Ing/mL ~100ng/mL。
5. -種間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括：將原代間充質(zhì)干細(xì)胞接種于權(quán) 利要求4所述的培養(yǎng)基中，經(jīng)培養(yǎng)獲得Pl代間充質(zhì)干細(xì)胞后傳代。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述接種的密度為5000個(gè)/cm 2。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述培養(yǎng)的條件為37°C，5% CO 2， 95 %濕度。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述培養(yǎng)的時(shí)間為3天。
9. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述傳代的次數(shù)為5次。
10. 根據(jù)權(quán)利要求5~9任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述間充質(zhì)干細(xì)胞為人 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞或人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞。
【專利摘要】本發(fā)明涉及干細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域，尤其涉及Y-27632在間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用及間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法。本發(fā)明提供了Y-27632作為間充質(zhì)干細(xì)胞增殖促進(jìn)劑的應(yīng)用。本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，相同培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)基中添加Y-27632能夠促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖，本發(fā)明還提供了培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法，實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)培養(yǎng)五代后，與未添加Y-27632的對(duì)照組相比，添加Y-27632的實(shí)驗(yàn)組中，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量提高31.87％；羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量提高30％，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量提高27.27％。
【IPC分類】C12N5-0775
【公開號(hào)】CN104830763
【申請?zhí)枴緾N201510288527
【發(fā)明人】王一飛, 陳海佳, 葛嘯虎, 黎娟妹, 王小燕, 李平
【申請人】廣州賽萊拉干細(xì)胞科技股份有限公司
【公開日】2015年8月12日
【申請日】2015年5月29日