草魚呼腸孤病毒s7基因突變株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及草魚呼腸孤病毒，具體地說，涉及一種草魚呼腸孤病毒S7基因突變株 及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 病毒性草魚出血病一直制約我國(guó)草魚養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，具有發(fā)病急、感染性強(qiáng)、 傳播速度快、流行范圍廣、治療困難、死亡率高等特點(diǎn)。農(nóng)業(yè)部公告第1125號(hào)發(fā)布的《一、 二、三類動(dòng)物疫病病種名錄》（2008)，在防疫名錄中水生動(dòng)物疫病種類有36種，其中草魚出 血病被列為二類疫病。草魚呼腸孤病毒（Grasscarpreovirus，GCRV)是草魚出血病的致 病病原。
[0003]GCRV主要由核酸基因組和蛋白質(zhì)衣殼組成。同其它無(wú)囊膜病毒一樣，其基因組為 病毒增殖和遺傳變異提供遺傳信息，衣殼則保護(hù)核酸免受外界因素影響和破壞，并可介導(dǎo) 病毒核酸進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。GCRV病毒粒子為20面體對(duì)稱的球形顆粒，在形態(tài)和基因組結(jié)構(gòu)上 與哺乳動(dòng)物呼腸孤病毒（Ma_alianreovirus，MRV)具有相似之處，但二者編碼蛋白質(zhì)的氨 基酸序列的同源性小于20%。GCRV的基因組由11條分節(jié)段雙鏈RNA構(gòu)成，編碼的12個(gè)蛋 白質(zhì)中含7個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和5個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白。
[0004] 研宄GCRV基因組結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系對(duì)于了解GCRV的致病機(jī)理以進(jìn)一步防治草魚 出血病具有重要的意義，而突變株是比較性的研宄基因功能的有力工具。目前GeneBank全 基因組收錄的GCRV毒株主要有GCRV-873、GCRV-104、GCRV-GD108、GCRV-HZ08 和AGCRV毒 株，但是發(fā)現(xiàn)更多的突變株仍然是十分必要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種草魚呼腸孤病毒S7基因突變 株。
[0006] 本發(fā)明的再一的目的是，提供所述的草魚呼腸孤病毒S7基因突變株的用途。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0008] 一種草魚呼腸孤病毒S7基因突變株，所述的草魚呼腸孤病毒S7基因突變株的保 藏號(hào)為CCTCCNO:V201515。
[0009] 為實(shí)現(xiàn)上述第二個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0010] 如上所述的草魚呼腸孤病毒S7基因突變株的用途，所述的用途選自：
[0011]a)用于研宄草魚呼腸孤病毒基因或蛋白的功能；
[0012] b)比較性地研宄同一種草魚呼腸孤病毒不同突變型；或
[0013] c)用于建立草魚出血病動(dòng)物模型。
[0014] 本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于：
[0015] 本發(fā)明分離純化得到一株草魚呼腸孤病毒突變株，于2015年3月27日保藏于中 國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（中國(guó)武漢大學(xué)，430072)，保藏編號(hào)為CCTCCN0:V201515,培養(yǎng)物 名稱：草魚呼腸孤病毒S7基因突變株GCRV-JX02-S7SD。研宄發(fā)現(xiàn)該病毒株感染CIK細(xì)胞 后不產(chǎn)生明顯的細(xì)胞病變效應(yīng)，并能在CIK細(xì)胞中復(fù)制擴(kuò)增，序列分析表明該病毒株相比 于GCRV-HZ08株S7基因（⑶350744)在GCRV-HZ08株S7基因583bp至1008bp處出現(xiàn)基因 缺失，缺失片段為426bp，并且S2中間也出現(xiàn)3個(gè)堿基的缺失引起一小段編碼的氨基酸序列 變異。本發(fā)明的草魚呼腸孤病毒突變株為比較性地研宄同一種草魚呼腸孤病毒不同突變型 提供了生物學(xué)材料，提示VP56蛋白質(zhì)在該基因型病毒感染擴(kuò)增過程中不是必需的蛋白質(zhì)， 有助于進(jìn)一步研宄草魚呼腸孤病毒的增殖和感染機(jī)制，以有效防治草魚出血病。
【附圖說明】
[0016] 圖1.草魚呼腸孤病毒S7基因突變株GCRV-JX02-S7SD感染CIK細(xì)胞的顯微鏡照 片。
[0017] 圖2.草魚呼腸孤病毒S7基因突變株GCRV-JX02-S7SD的S1~S9片段的PCR檢 測(cè)。M.DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)。
[0018] 圖3.草魚呼腸孤病毒S7基因突變株GCRV-JX02-S7SD S7CDS框與GCRV-HZ08S7 序列比對(duì)圖。
[0019] 圖4.草魚呼腸孤病毒S7基因突變株GCRV-JX02-S7SD S2與GCRV-HZ08S2片段部 分核苷酸序列以及編碼的氨基酸序列的比對(duì)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明提供的【具體實(shí)施方式】作詳細(xì)說明。
[0021] 本發(fā)明從江西草魚養(yǎng)殖場(chǎng)疑似草魚出血病病魚體分離一株病毒，在CIK細(xì)胞系中 進(jìn)行無(wú)限稀釋法傳代分離純化病毒，盲傳80代后進(jìn)行梯度離心，超速離心后收集病毒進(jìn)行 序列分析。該病毒已于2015年3月27日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（中國(guó)武漢大 學(xué)，430072)，保藏編號(hào)為CCTCCNO:V201515,培養(yǎng)物名稱：草魚呼腸孤病毒S7基因突變株 GCRV-JX02-S7SD。
[0022] 1材料和方法
[0023] 1. 1儀器和設(shè)備
[0024] 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：力康生物醫(yī)療科技控股有限公司；
[0025] 漩渦混合器：上海琪特分析儀器有限公司；
[0026] 2-KTC冷藏箱：Haier;
[0027] 低溫保存箱：Haier;
[0028] 凈化工作臺(tái)：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司
[0029]電泳儀：Tanon;
[0030] 基因研宄型純水儀：艾科浦；
[0031]微波爐：Galanza ;
[0032] 細(xì)胞恒溫恒濕培養(yǎng)箱：上海安亭科技儀器有限公司；
[0033] NAN0DR0P2000：ThermoScientific；
[0034]GelImageSystem：Tanon；
[0035]TIOOThermal Cycler：BI〇-RAD；
[0036] 1X71倒置式研宄型顯微鏡OLYMPUS。
[0037] 1. 2材料和試劑
[0038] 草魚腎細(xì)胞（CIK)由本實(shí)驗(yàn)室保存并傳代；草魚呼腸孤病毒于2011年8月采自江 西地區(qū)疑似草魚出血病發(fā)病魚塘，癥狀突出表現(xiàn)為鰭基、鰓蓋、眼眶明顯充血，局部皮膚塊 狀充血，帶回實(shí)驗(yàn)室在CIK細(xì)胞系中進(jìn)行無(wú)限稀釋法傳代分離純化病毒，-80°C保存。
[0039]Mediuml99培養(yǎng)液、胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司；TrizolReagent購(gòu)自 Invitrogen;引物均由上海生工合成；DL2000DNAMarker、PrimerScripit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、 PyrobestTMDNAPolymerase購(gòu)自TaKaRa，其余試劑（瓊脂糖）均購(gòu)自上海生工公司。
[0040] 1.3所用軟件
[0041] NCBIBlast在線比對(duì)軟件（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)，DNAssist序列 分析軟件，引物設(shè)計(jì)軟件PrimerPremier5.0。
[0042] 1. 4實(shí)驗(yàn)方法
[0043] 1. 4. 1CIK細(xì)胞的傳代培養(yǎng)
[0044] 倒置顯微鏡下觀察到CIK細(xì)胞長(zhǎng)成致密單層即可進(jìn)行傳代。對(duì)凈化工作臺(tái)紫外消 毒后，吸出原有培養(yǎng)液，加入適量Medium199培養(yǎng)液清洗并吸出細(xì)胞碎片。按每25cm2細(xì) 胞培養(yǎng)瓶加入lml0. 25%Trypsin&O. 02%EDTA，顯微鏡下觀察，細(xì)胞呈收縮狀變圓并出現(xiàn) 細(xì)小空隙，吸出胰酶，加入5ml含有10%胎牛血清的M199培養(yǎng)液中和，吹打至分散均勻。將 細(xì)胞懸液分裝至培養(yǎng)瓶，置28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0045] 1. 4. 2GCRV的增殖
[0046] 培養(yǎng)CIK細(xì)胞至匯合單層，吸出培養(yǎng)液，加入1ml培養(yǎng)液清洗細(xì)胞碎片后吸出。加 入lml分尚好的病毒液，28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)lh，使病毒吸附細(xì)胞。棄去病毒液，加入5ml含 有2%胎牛血清的M199培養(yǎng)液，置28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，收集上清。反復(fù)凍融3次， 8000rpm離心 30min，_20°C保存上清。
[0047] 1. 4. 3病毒基因組（dsRNA)的提取
[0048] (1)病毒基因組dsRNA的提取參考Attoui(AttouiH.，BilloirF.，Cantaloube J.F.etal.StrategiesforthesequencedeterminationofviraldsRNAgenomes. JournalofVirologicalMethods, 2000,89:147-158.)和Maan(MaanS，Rao S.J. ,AttouiH.etal.RapidcDNAsynthesisandsequencingtechniquesforthe geneticstudyofbluetongueandotherdsRNAviruses.JournalofVirological Methods, 2007, 143:132-139.)。吸出培養(yǎng)液，加入lmlTRIzol?Reagent，室溫放置 5min， 用槍頭將CIK細(xì)胞刮下，移至1.5mlEP管；
[0049] (2)每lmlTRIzol加入0? 2ml三氯甲烷，劇烈搖晃15s后室溫靜置5min;
[0050] (3)4°C，12000rpm，離心15min，吸取上層透明液相并移入新管中，體積大約為 0.5ml;
[0051] (4)加入等體積異丙醇（0. 5ml)，混合均勻，室溫放置10min;
[0052](5) 4°C，12000rpm，離心 15min;
[0053] (6)棄去上清，加入lmlDEPC水配制的75 %的乙醇清洗RNA沉淀；
[0054](7) 4°C，12000rpm，離心10min，棄去上清液，放于凈化工作臺(tái)或真空干燥 5-10min；
[0055] (8)用適量的RNase-free Water溶解RNA沉淀，測(cè)定其濃度。
[0056] 1. 4. 4基因組全長(zhǎng)cDNA的合成
[0057] (1)模板RNA (dsRNA連接產(chǎn)物）5 u g，Random 6mers (50 u m) 1 u 1，用RNase free ddH20將體系補(bǔ)充至lOy l，65°C，5min ;
[0058] (2)迅速冰上冷卻5min，離心數(shù)秒，使液體集中于管底；
[0059] (3)向上述溶液中加入5XPrimerScripit Buffer 4 y 1，dNTP Mixture(各 lOmM) 1 y 1，RNase Inhibitor (40U/ y 1)0. 5 y 1, PrimerScripit Transcriptase lyl，混 勻；
[0060] (4)反應(yīng)條件：30°〇，101^11;42°〇，111;95°〇，5111111。測(cè)定其濃度。1.4.5雙引物？〇? 擴(kuò)增
[0061] 根據(jù)GenBank上提交的GCRV-HZ08的S1~S9基因序列，運(yùn)用軟件PrimerPremier 5. 0分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增每個(gè)基因0RF框的引物，對(duì)于部分較長(zhǎng)基因（Sl，S2,S3,S5)采取分段擴(kuò) 增后拼接的辦法。
[0062] 表1引物序列
[0063]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種草魚呼腸孤病毒S7基因突變株，其特征在于，所述的草魚呼腸孤病毒S7基因突 變株的保藏號(hào)為CCTCC NO !V201515。
2. 權(quán)利要求1所述的草魚呼腸孤病毒S7基因突變株的用途，其特征在于，所述的用途 選自： a) 用于研宄草魚呼腸孤病毒基因或蛋白的功能； b) 比較性地研宄同一種草魚呼腸孤病毒不同突變型；或 c) 用于建立草魚出血病動(dòng)物模型。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種草魚呼腸孤病毒S7基因突變株及其應(yīng)用，該突變株的保藏號(hào)為CCTCC NO：V201515。研究發(fā)現(xiàn)該突變株感染CIK細(xì)胞后不產(chǎn)生明顯的細(xì)胞病變效應(yīng)，并能在CIK細(xì)胞中復(fù)制擴(kuò)增，序列分析表明該突變株相比于GCRV-HZ08株S7基因在583bp至1008bp處出現(xiàn)基因缺失，缺失片段為426bp，并且S2中間也出現(xiàn)3個(gè)堿基的缺失引起一小段編碼的氨基酸序列變異。本發(fā)明的突變株為比較性地研究同一種草魚呼腸孤病毒不同突變型提供了生物學(xué)材料，提示VP56蛋白質(zhì)在該基因型病毒感染擴(kuò)增過程中不是必需的蛋白質(zhì)，有助于進(jìn)一步研究草魚呼腸孤病毒的增殖和感染機(jī)制，以有效防治草魚出血病。CCTCC NO：V20151520150327
【IPC分類】C12N7-00, C12R1-93, C12Q1-68, A01K67-027, G01N33-68
【公開號(hào)】CN104830808
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510206857
【發(fā)明人】王浩, 呂利群, 宗乾坤, 許丹, 喻飛, 魯建飛, 夏思瑤
【申請(qǐng)人】上海海洋大學(xué)
【公開日】2015年8月12日
【申請(qǐng)日】2015年4月27日