一種d型水解酶的生產(chǎn)工藝的制作方法
【專利說(shuō)明】一種D型水解酶的生產(chǎn)工藝
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種D型水解酶的生產(chǎn)工藝。
【背景技術(shù)】
[0003]D-色氨酸作為一種非蛋白光學(xué)活性氨基酸，具有特殊的生理學(xué)性質(zhì)，在食品、飼料工業(yè)以及農(nóng)業(yè)中均有一定的價(jià)值，可以作為非營(yíng)養(yǎng)性甜味劑、飼料添加劑、植物生長(zhǎng)劑。特別是在醫(yī)藥行業(yè)中，D-色氨酸是抗癌劑和免疫抑制劑的重要合成前體。
[0004]現(xiàn)有技術(shù)中，關(guān)于D-色氨酸的制備方法主要有拆分法和生物法。其中，拆分法包括:1)膜拆分法，膜法拆分因具有快速方便、相對(duì)能量損失較低以及操作連續(xù)的優(yōu)點(diǎn)，可以用來(lái)分離處理大量的消旋體；2)酶法拆分，有三種方法:a)酶促水解法，上海市生物化學(xué)研宄所用高活力的固定化的?；被崴饷覆鸱諨L-乙酰色氨酸；b)酶降解法，單孢菌屬、腸桿菌屬、變形桿菌屬等類微生物產(chǎn)生的色氨酸酶能將DL-色氨酸消旋體中的L-色氨酸降解為吲哚、氨和丙酮酸；c)酰胺酶法，L-酰胺酶來(lái)源于紅酵母細(xì)胞，它是L-型酰胺特異性水解酶，能選擇性地將DL-色氨酸酰胺中的L-型降解為L(zhǎng)-色氨酸。
[0005]生物法合成光學(xué)活性物質(zhì)實(shí)質(zhì)上就是利用微生物體內(nèi)的酶，在新陳代謝過(guò)程中將合適的底物經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)轉(zhuǎn)化成所需要的產(chǎn)物，故該法又稱為酶法轉(zhuǎn)化。生物法包括:
1)轉(zhuǎn)氨酶法，枯草桿菌屬等體內(nèi)存在著D-氨基酸轉(zhuǎn)移酶，它屬枯草桿菌屬、細(xì)菌等，與各種L-氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶比較，D-氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶最大的優(yōu)點(diǎn)是對(duì)L-氨基酸完全沒(méi)有作用；
2)海因酶法，海因酶(又稱二氫嘧啶酶)是廣泛存在于動(dòng)植物組織中的一種水解酶，它不僅能水解打開(kāi)二氫嘧啶環(huán)，并且還可以水解與二氫嘧啶結(jié)構(gòu)類似的海因類化合物，中性的天然或非天然的氨基酸的海因都可作此酶的底物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]發(fā)明目的:本發(fā)明提供一種D型水解酶的生產(chǎn)工藝，通過(guò)菌種培養(yǎng)，發(fā)酵，純化等得到的D型水解酶，純度達(dá)到99%，生產(chǎn)成本低，工藝簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫和，既簡(jiǎn)便又高效。
[0007]技術(shù)方案:一種D型水解酶的生產(chǎn)工藝，包括如下步驟:菌種培養(yǎng)一一種子培養(yǎng)一一發(fā)酵前準(zhǔn)備一一發(fā)酵一一提取一一純化一一成品；
具體步驟如下:
(1)、菌種培養(yǎng):菌種在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行斜面活化培養(yǎng)20-24h，培養(yǎng)溫度為32°C；
(2)、種子培養(yǎng):將活化的菌種接入種子培養(yǎng)基中，溫度控制在32°C，通風(fēng)比控制在1:1，流加堿水，控制PH在7.0-7.2，通過(guò)流加泡敵消泡，攪拌轉(zhuǎn)速400r/min ；
所述種子培養(yǎng)基的配比:葡萄糖40g/L，(NH4)2 4.0g/L，酵母浸膏粉6g/L，KH2P04 l.0g/L，NgSO4 0.4g/L，MnSO4 0.01g/L，F(xiàn)eSO4 0.01g/L，玉米漿 30ml，VB 300ug，VH 200ug，pH:7.0-7.2 ；
(3)、發(fā)酵前準(zhǔn)備:發(fā)酵罐在溫度123°C-125°C下空消30min-50min，然后注入純凈水，按種子培養(yǎng)基的配比配好培養(yǎng)基進(jìn)行實(shí)消，溫度123°C _125°C，時(shí)間為30min-50min ;
(4)、發(fā)酵:將實(shí)消好的培養(yǎng)基降溫至32°C-35°C，按10%-15%的比例接入種子發(fā)酵液，pH控制在7.0-7.2，通風(fēng)比控制在1:1，攪拌轉(zhuǎn)速40-60r/min，進(jìn)行發(fā)酵20_24h ；
(5)、提取:將發(fā)酵好的發(fā)酵液通過(guò)粗過(guò)濾、精過(guò)濾后，得到D型水解酶溶液粗酶液；
(6)、純化:將粗酶液粉碎lh，配以3倍的乙醇得到沉淀物，離心去除上層液，得到濕品酶；
(7)、成品:將濕酶經(jīng)過(guò)冷凍干燥得到成品D型水解酶，包裝冷藏保存。
[0008]作為優(yōu)化:所述步驟(I)中，菌種培養(yǎng):菌種在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行斜面活化培養(yǎng)22h，培養(yǎng)溫度為32 °C。
[0009]作為優(yōu)化:所述步驟(2)中，種子培養(yǎng):將活化的菌種接入種子培養(yǎng)基中，溫度控制在32°C，通風(fēng)比控制在1:1，流加堿水，控制PH在7.1，通過(guò)流加泡敵消泡，攪拌轉(zhuǎn)速400r/mino
[0010]作為優(yōu)化:所述步驟(3)中，發(fā)酵前準(zhǔn)備:發(fā)酵罐在溫度124°C下空消40min，然后注入純凈水，按種子培養(yǎng)基的配比配好培養(yǎng)基進(jìn)行實(shí)消，溫度124°C，時(shí)間為40min。
[0011]作為優(yōu)化:所述(4)中，發(fā)酵:將實(shí)消好的培養(yǎng)基降溫至34°C，按13%的比例接入種子發(fā)酵液，pH控制在7.1，通風(fēng)比控制在1:1，攪拌轉(zhuǎn)速50r/min，進(jìn)行發(fā)酵23h。
[0012]有益效果:本發(fā)明通過(guò)菌種培養(yǎng)，發(fā)酵，純化等得到的D型水解酶，純度達(dá)到99%，生產(chǎn)成本低，工藝簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫和，既簡(jiǎn)便又高效。
【具體實(shí)施方式】
[0013]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)闡述。
[0014]具體實(shí)施例一:
一種D型水解酶的生產(chǎn)工藝，包括如下步驟:菌種培養(yǎng)一一種子培養(yǎng)一一發(fā)酵前準(zhǔn)備一一發(fā)酵一一提取一一純化一一成品；
具體步驟如下:
(1)、菌種培養(yǎng):菌種在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行斜面活化培養(yǎng)20h，培養(yǎng)溫度為32°C；
(2)、種子培養(yǎng):將活化的菌種接入種子培養(yǎng)基中，溫度控制在32°C，通風(fēng)比控制在1:1，流加堿水，控制PH在7.0，通過(guò)流加泡敵消泡，攪拌轉(zhuǎn)速400r/min ；
所述種子培養(yǎng)基的配比:葡萄糖40g/L，(NH4)2 4.0g/L，酵母浸膏粉6g/L，KH2P04 l.0g/L，NgSO4 0.4g/L，MnSO4 0.01g/L，F(xiàn)eSO4 0.01g/L，玉米漿 30ml，VB 300ug，VH 200ug，pH:7.0 ；
(3)、發(fā)酵前準(zhǔn)備:發(fā)酵罐在溫度123°C下空消30min，然后注入純凈水，按種子培養(yǎng)基的配比配好培養(yǎng)基進(jìn)行實(shí)消，溫度123°C，時(shí)間為30min ;
(4)、發(fā)酵:將實(shí)消好的培養(yǎng)基降溫至32°C，按10%的比例接入種子發(fā)酵液，pH控制在7.0，通風(fēng)比控制在1:1，攪拌轉(zhuǎn)速40r/min，進(jìn)行發(fā)酵20h ；
(5)、提取:將發(fā)酵好的發(fā)酵液通過(guò)粗過(guò)濾、精過(guò)濾后，得到D型水解酶溶液粗酶液；
(6)、純化:將粗酶液粉碎lh，配以3倍的乙醇得到沉淀物，離心去除上層液，得到濕品酶；
(7)、成品:將濕酶經(jīng)過(guò)冷凍干燥得到成品D型水解酶，包裝冷藏保存。
[0015]具體實(shí)施例二:
一種D型水解