一種茶樹(shù)miRNA及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種茶樹(shù)miRNA及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 茶葉是很多人日常生活中的必需品，深受大眾的喜愛(ài)。茶多酚是茶葉品質(zhì)成分中 最重要的化學(xué)成分之一，約占茶葉干重的18~36%，包括酚酸、黃酮酸、黃烷-3-醇（兒茶 素）、黃酮、花青素和原花青素等，是提高茶葉品質(zhì)的重要影響因素。在這其中，兒茶素又是 決定茶葉品質(zhì)和健康功效的主要成分之一，兒茶素的合成受到光照、溫度、土壤環(huán)境等因素 的影響，氮素作為茶樹(shù)最為重要的營(yíng)養(yǎng)元素之一，對(duì)茶樹(shù)的兒茶素合成也有重要影響。目 前，從茶樹(shù)中已克隆得到兒茶素合成相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因，如CHS，DFR，ANR等；與此同時(shí)，研宄 人員相繼發(fā)現(xiàn)和鑒定了許多相關(guān)的調(diào)控基因如MYB、bHLH、WD40等轉(zhuǎn)錄因子。
[0003]microRNA(miRNA)是由18~25個(gè)核苷酸組成的非編碼RNA，首先由核基因組 轉(zhuǎn)錄，形成帶帽狀結(jié)構(gòu)和多聚腺苷尾巴的初級(jí)miRNA(pri-miRNA)。pri-miRNA經(jīng)核酸酶 Drosha處理后形成約70nt的含莖環(huán)節(jié)的前提miRNA(pre-miRNA)，其后又經(jīng)核酸酶剪切為 成熟的miRNA。miRNA通過(guò)堿基非完全配對(duì)與靶基因mRNA3'UTR序列結(jié)合，引導(dǎo)沉默復(fù)合 體（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)降解mRNA或抑制mRNA的翻譯，從而調(diào)控基因 的表達(dá)。一個(gè)miRNA可結(jié)合多個(gè)革E1基因，而一個(gè)mRNA也可由多個(gè)miRNA共同調(diào)節(jié)。這個(gè)復(fù) 雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)既可以通過(guò)一個(gè)miRNA來(lái)調(diào)控多個(gè)基因的表達(dá)，也可以通過(guò)幾個(gè)miRNA的組 合來(lái)精細(xì)調(diào)控某個(gè)基因的表達(dá)。
[0004] 現(xiàn)今，對(duì)于植物miRNA及其生物學(xué)功能的研宄已經(jīng)成為熱點(diǎn)。目前，已經(jīng)有193 個(gè)物種，21264條前體的miRNA和25141條成熟miRNA收錄在11111?1^8619.0(111:丨。：//\￥￥￥. mirbase.org/release19 :2012. 8)，且研宄對(duì)象主要集中于草木植物擬南芥和禾本科水 稻、玉米，對(duì)于木本植物的報(bào)道較少，而關(guān)于茶樹(shù)的miRNA序列信息在miRBase被發(fā)現(xiàn)的 更少。到目前為止，僅發(fā)現(xiàn)基于茶樹(shù)EST序列對(duì)miRNA進(jìn)行預(yù)測(cè)分析和通過(guò)傳統(tǒng)的直接 克隆方法鑒定了6個(gè)茶樹(shù)特有的11111?敵(?四811311〖]\1〇113即111'13 311(168111(1111^1￥3(1已￥. CharacterizationofnovelsmallRNAsfromtea.(CamelliasinensisL. ).MolBiol Rep.2012,39 ：3977-3986)〇
[0005] 因此，有必要進(jìn)一步發(fā)掘和鑒定茶樹(shù)中的功能性microRNA，尤其是能夠調(diào)控兒茶 素含量的microRNA，從而在分子水平上調(diào)控兒茶素含量，適應(yīng)不同的氮素條件，改善茶葉品 質(zhì)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供了一種茶樹(shù)miRNA及其應(yīng)用，該miRNA能夠調(diào)控茶樹(shù)中兒茶素的含量， 可應(yīng)用于茶樹(shù)茶葉品質(zhì)的改良。
[0007] 一種茶樹(shù)miRNA，其堿基序列如SEQIDNO. 1所示。
[0008] 上述茶樹(shù)miRNA的前體的堿基序列如SEQIDNO. 2所示。編碼上述茶樹(shù)miRNA的 前體的DNA片段，堿基序列如SEQIDNO. 3所示。
[0009] 本發(fā)明茶樹(shù)miRNA能夠抑制SPL轉(zhuǎn)錄因子家族成員基因的表達(dá)，進(jìn)而影響兒茶素 的表達(dá)量，所述SPL轉(zhuǎn)錄因子的EST序列的NCBI登陸號(hào)為HP74756、HP73470和HP74007。
[0010] 本發(fā)明還提供了所述的茶樹(shù)miRNA在抑制茶樹(shù)兒茶素表達(dá)中的應(yīng)用以及所述的 茶樹(shù)miRNA的前體在抑制茶樹(shù)兒茶素表達(dá)中的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明具有的有益效果：
[0012] 本發(fā)明通過(guò)Solexa高通量測(cè)序技術(shù)、生物信息學(xué)分析等技術(shù)，首次從茶樹(shù)浙農(nóng) 139中鑒定了miR156和其前體Cs-miR156g，并通過(guò)不同氮素處理驗(yàn)證了不同氮素條件 下miR156的表達(dá)差異，得出兒茶素總量與miR156呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系的結(jié)論，證明本發(fā)明 茶樹(shù)miRNA(miR156)及其前體Cs-miR156g在調(diào)控茶樹(shù)兒茶素表達(dá)中起到重要作用，茶樹(shù) miRNA(miR156)及其前體Cs-miR156g的表達(dá)可抑制茶樹(shù)中兒茶素的合成，在優(yōu)質(zhì)茶葉品種 的培育中具有潛在應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說(shuō)明】
[0013] 圖1為茶樹(shù)miR156與擬南芥miR156基因家族成員的親緣關(guān)系。
[0014]圖 2 為miR156 前體Cs-miR156g的二級(jí)結(jié)構(gòu)。
[0015] 圖3為不同氮素條件下茶樹(shù)新梢Cs-miR156g的表達(dá)量變化情況。
[0016] 圖4為不同氮素條件下靶基因（靶基因的EST序列的NCBI登陸號(hào)：HP74756， HP73470,HP74007)的表達(dá)量變化情況。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述和說(shuō)明，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限 于此。
[0018] 下列實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為本領(lǐng)域常規(guī)方法。所用的材料、試 劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑中獲得。
[0019] 實(shí)施例1miRNA的篩選和鑒定
[0020] 1、植物材料和樣品的準(zhǔn)備
[0021] 取茶樹(shù)（Camelliasinensis)浙農(nóng)139品種一年生扦插苗，置于人工氣候溫室中 水培，采摘茶樹(shù)幼苗的一芽二葉，液氮速凍后，_70°C下冷凍備用。
[0022] 2、茶樹(shù)miRNA的高通量測(cè)序
[0023] 采用Trizol法提取茶樹(shù)RNA:
[0024] 1)取茶樹(shù)新梢0. lg左右，迅速加液氮冷凍研磨成細(xì)粉狀；
[0025] 2)將研磨的粉末裝至經(jīng)DEPC處理的1. 5ml離心管中，加入1000y1Trizol試劑， 充分混勻，冰上放置5min;
[0026] 3)加入200yl氯仿，蓋緊樣品管蓋，用力搖置15s，使其充分混勻，靜置5min， 4°C12000r/min離心 15min;
[0027] 4)小心吸取上層水相500y1轉(zhuǎn)入新的離心管中，加入等體積異丙醇，上下輕輕顛 倒 10 次，室溫放置lOmin，4°C12000r/min離心lOmin;
[0028] 5)小心倒掉上清，留取沉淀，加入1ml現(xiàn)配75 %乙醇振蕩洗滌RNA-次， 4°C7500r/min離心 5min;
[0029] 6)倒去乙醇，留有沉淀的離心管置于超凈臺(tái)吹lOmin，加入30y1DEPC處理過(guò)的 ddH20溶解；
[0030] 7)通過(guò)微量分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取RNA質(zhì)量，所提取RNA0D260/ 0D280在1. 8左右，電泳顯示28S和18S條帶清晰，無(wú)降解，表明提取RNA質(zhì)量合格。提取質(zhì) 量合格的RNA用于構(gòu)建miRNA文庫(kù)，miRNA文庫(kù)的構(gòu)建按照IlluminaSampleSrepration Protocol文庫(kù)構(gòu)建方法進(jìn)行，然后，采用Solexa高通量測(cè)序，交由聯(lián)川生物技術(shù)有限公司 完成，獲得18~30nt的miRNA序列。
[0031] 3、miRNA的鑒定
[0032]Solexa測(cè)序得到rawreads數(shù)據(jù)后，對(duì)Solexa測(cè)序所得的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信 息學(xué)分析，首先通過(guò)對(duì)步驟（2)中獲得的原始序列進(jìn)行去接頭、去低質(zhì)量、去污染、去載體 序列等處理，得到可用于后續(xù)分析的干凈序列；然后，將所得到的干凈序列通過(guò)相應(yīng)數(shù)據(jù)庫(kù) miRBase進(jìn)行比對(duì)，利用物種同源性比對(duì)分析，與其他植物物質(zhì)micrRNA錯(cuò)配不大于2個(gè)的 序列；再將其與已有的茶樹(shù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST，將比對(duì)到的茶樹(shù)EST序列進(jìn)行二級(jí)結(jié) 構(gòu)分析，若能形成類(lèi)似miRNA前體（pre-miRNA)的穩(wěn)定莖環(huán)結(jié)構(gòu)則該序列可以認(rèn)為是茶樹(shù) 的miRNA。通過(guò)該方法，鑒定出茶樹(shù)的miR156,其成熟序列為：GUGACAGAAGAGAGUGAGCAC(如 SEQIDN0. 1 所示）。
[0033] 4、mil56靶基因的預(yù)測(cè)
[0034]采用在線(xiàn)預(yù)測(cè)軟件程序psRNATarget(http://plantgr.nole.org/psRNATarget/) 預(yù)測(cè)并注釋茶樹(shù)的靶基因，獲得miR156對(duì)應(yīng)的靶基因的NCBI登陸號(hào)為：HP74756,HP73470， HP74007的三條EST序列。
[0035] 實(shí)施例2茶樹(shù)Cs_miR156g前體序列的克隆
[0036]1、植物材料和樣品的準(zhǔn)備
[0037] 取茶樹(shù)（Camelliasinensis)浙農(nóng)139品種一年生扦插苗，置于人工氣候溫室中 水培，采摘茶樹(shù)的一芽二葉，液氮速凍后，置于-70°C用于DNA的提取。
[0038]2、植物基因組DNA的提取
[0039] 采用CTAB法提取茶樹(shù)基因組DNA:
[0040] 1)取茶樹(shù)材料0.lg左右，置研缽液氮研磨成粉末，轉(zhuǎn)至1. 5ml離心管；
[0041] 2)輕輕攪動(dòng)，65°C水浴lh(每隔10min，輕輕攪動(dòng)）
[0042] 3)冷卻至室溫后，加等體積氯仿/異戊醇，混勾輕搖，靜置5min，10000r/min離心 10min；
[0043] 4)吸上清液于新的離心管中，加等體積氯仿/異戊醇，重復(fù)步驟3);
[0044] 5)吸上清液，加等體積的異丙醇混勻，-20°C靜置lh;
[0045] 6) 5000r/min離心 5min，收集沉淀；
[0046] 7)用70%乙醇洗DNA3次，離心管倒置吸水紙，DNA干燥，加200y1ddH20溶解；
[0047] 8)微量分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取基因組DNA質(zhì)量。所提取DNA 0D260/0D280在2. 0左右，電泳有清晰條帶。
[0048] 3、miR156前體序列的擴(kuò)增
[0049] 以提取合格基因組DNA為模板，根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的miR156前體序列，設(shè)計(jì)引 物如下：
[0050] 上游引物FI:TTTGAAGGGTAAGAGAGGTGAC;
[0051] 下游引物R1 :AGAGAGAGGAAGAGAGAATGGIT，配制PCR反應(yīng)體系（50y1):
[0052]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種茶樹(shù)miRNA，其特征在于，堿基序列如SEQ ID NO. 1所示。
2. -種茶樹(shù)miRNA的前體，其特征在于，堿基序列如SEQ ID NO. 2所示。
3. 如權(quán)利要求2所述茶樹(shù)miRNA的前體的DNA片段，其特征在于，堿基序列如SEQ ID NO. 3所示。
4. 如權(quán)利要求1所述的茶樹(shù)miRNA在抑制SPL轉(zhuǎn)錄因子家族成員基因表達(dá)中的應(yīng)用， 所述SPL轉(zhuǎn)錄因子的EST序列的NCBI登陸號(hào)為HP74756、HP73470和HP74007。
5. 如權(quán)利要求1所述的茶樹(shù)miRNA在抑制茶樹(shù)兒茶素表達(dá)中的應(yīng)用。
6. 如權(quán)利要求2所述的茶樹(shù)miRNA的前體在抑制茶樹(shù)兒茶素表達(dá)中的應(yīng)用。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種茶樹(shù)miRNA及其應(yīng)用，該茶樹(shù)miRNA的堿基序列如SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明通過(guò)Solexa高通量測(cè)序技術(shù)、生物信息學(xué)分析等技術(shù)，首次從茶樹(shù)浙農(nóng)139中鑒定了miR156及其前體Cs-miR156g，并通過(guò)不同氮素處理驗(yàn)證了不同氮素條件下miR156的表達(dá)差異，得出兒茶素總量與miR156呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系的結(jié)論，證明本發(fā)明茶樹(shù)miRNA(miR156)及其前體Cs-miR156g在調(diào)控茶樹(shù)兒茶素表達(dá)中起到重要作用，茶樹(shù)miRNA(miR156)及其前體Cs-miR156g的表達(dá)可抑制茶樹(shù)中兒茶素的合成，在優(yōu)質(zhì)茶葉品種的培育中具有潛在應(yīng)用價(jià)值。
【IPC分類(lèi)】A01H5-00, C12N15-113
【公開(kāi)號(hào)】CN104830859
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510201694
【發(fā)明人】王校常, 范凱, 范冬梅, 陸亞婷, 蘇彥華
【申請(qǐng)人】浙江大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年8月12日
【申請(qǐng)日】2015年4月24日