馬立克氏病病毒弱毒疫苗814株的反向遺傳操作系統(tǒng)及其在病毒拯救中的應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及病毒遺傳操作領域，更具體地，本發(fā)明涉及一種馬立克氏病病毒弱毒 疫苗814株的反向遺傳操作系統(tǒng)及其在病毒拯救中的應用。
【背景技術】
[0002] 馬立克氏?。∕D)是由馬立克氏病病毒（MDV)引起的一種雞的傳染性腫瘤病，以淋 巴組織增生和腫瘤形成為特征，外周神經(jīng)、性腺、虹膜、各種臟器、肌肉和皮膚發(fā)生單核細胞 浸潤。MDV經(jīng)空氣傳播，傳染力很強，被感染雞產(chǎn)生腫瘤和死亡，造成巨大經(jīng)濟損失。馬立克 氏病是雞的主要疾病之一，也是國內(nèi)外50年代以來最受重視的雞病。
[0003] MDV屬于細胞結合性皰瘆病毒，其基因組為線狀雙股DNA。MDV包括三種血清 型，血清1型病毒具有致瘤性，可進一步分為幾個病理型，包括溫和型MDV(mMDV)、強毒型 MDV(vMDV)、超強毒型MDV(vvMDV)及特超強毒型MDV(vv+MDV)病毒株。雞的非致瘤病毒分 離株和火雞皰瘆病毒分離株分別稱作血清2型和3型MDV。當前現(xiàn)地用于MDV預防的疫苗 主要是血清1型弱毒疫苗，814疫苗株是其代表毒株之一。814疫苗株基因組全長約174kb， 該疫苗株自從上世紀80年代以來，安全使用30余年，無任何不良反應。814疫苗免疫效力 高，可以對vv+MDV產(chǎn)生良好的免疫保護效果。而且該疫苗株是一個自然弱毒株，具有十分 穩(wěn)定的生物性狀。因此，814疫苗株可以作為一個理想的載體，用于MDV活載體疫苗的研宄。
[0004] 常用的構建MDV重組病毒的方法主要有三種。一種是同源重組法，即將外源基因 插入到入門質(zhì)粒中轉染病毒感染細胞或并與病毒基因組共轉染易感細胞。該方法構建過程 復雜費時而且效率較低，需要加入篩選標記基因并進行重組病毒的純化。第二種是細菌人 工染色體（BAC)法，它是將完整的MDV基因組插入到BAC中并在細菌中對其進行改造。BAC 法是建立在同源重組基礎上的，同樣具有構建過程復雜、周期長的缺點。而且BAC自身序列 難以去除，使得后期獲得的重組病毒帶有不必要的外源基因序列。第三種是粘粒法。粘粒是 一種可以容納30-45kb大小外源DNA的克隆載體，常用于基因文庫的構建。該方法是將MDV 基因組分段插入到粘粒中，然后共轉染易感細胞拯救重組病毒，具有操作簡便、構建周期短 并易于進行改造的優(yōu)點。其中Cosmid是一種傳統(tǒng)的粘粒，它使用與質(zhì)粒相同的復制子，其 較高的拷貝數(shù)使其所建文庫穩(wěn)定性較低，且具有一定的偏向性。而Fosmid是最近幾年才 廣泛用于基因文庫構建的一種粘粒，具有穩(wěn)定性好、無偏向性、拷貝數(shù)可誘導、構建周期短 以及操作簡便等諸多優(yōu)點，其構建的基因文庫保真性和穩(wěn)定性均比Cosmid好，是目前用于 替代 Cosmid 的新型粘粒（Vinayak, S.，Brooks, C. F.，Naumov, A.，Suvorova, E. S.，White, M. W. ,Striepen,B. Genetic manipulation of the Toxoplasma gondii genome by fosmid recombineering. MBio. 2014, 5 (6) : e02021.) D 應用 Fosmid 構建 814 疫苗株反向遺傳操作 系統(tǒng)并用其進行重組病毒的拯救，可以為MDV活載體疫苗的研究奠定堅實的基礎，具有重 要的應用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的之一在于提供一種馬立克氏病病毒弱毒疫苗814株的反向遺傳操作 系統(tǒng)。
[0006] 本發(fā)明的目的之二在于提供一種構建所述馬立克氏病病毒弱毒疫苗814株的反 向遺傳操作系統(tǒng)的方法。
[0007] 本發(fā)明的目的之三在于提供所述馬立克氏病病毒弱毒疫苗814株的反向遺傳操 作系統(tǒng)在病毒拯救中的應用。
[0008] 為了達到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術手段：
[0009] 本發(fā)明的一種馬立克氏病病毒弱毒疫苗814株的反向遺傳操作系統(tǒng)，包含5 個分別依次含有馬立克氏病病毒弱毒疫苗814株基因組1-47873位、40028-79118位、 72447-113806位、106337-139612位和129115-172541位核苷酸序列的重組粘粒，其中所述 的馬立克氏病病毒弱毒疫苗814株全基因組序列的GeneBank登錄號為JF742597。
[0010] 在本發(fā)明的一個具體實施例中，所述系統(tǒng)中的5個重組粘粒是通過將馬立克氏病 病毒弱毒疫苗 814 株基因組 1-47873 位、40028-79118 位、72447-113806 位、106337-139612 位和129115-172541位核苷酸序列插入pCCIFos載體后得到的。
[0011] 進一步的，本發(fā)明還提出了一種構建馬立克氏病病毒弱毒疫苗814株的反向遺傳 操作系統(tǒng)的方法，其包括以下步驟：
[0012] 1)病毒培養(yǎng)及基因組提取
[0013] 將馬立克氏病病毒弱毒疫苗814株接種雞胚成纖維細胞，待病毒生長至85-95% 的細胞產(chǎn)生病變時收集細胞，提取病毒基因組DNA，經(jīng)脈沖場電泳鑒定；
[0014] 2)馬立克氏病病毒弱毒疫苗814株基因組Fosmid文庫的構建
[0015] 將病毒基因組DNA用200微升移液器吸頭抽吸多次進行打斷處理，將打斷后的DNA 片段進行平末端化和去磷酸化；經(jīng)脈沖場電泳后，回收35-48kb之間的DNA片段；將回收產(chǎn) 物連接到pCCIFos載體上，室溫孵育16-18h ;連接產(chǎn)物轉染大腸桿菌，涂布于含氯霉素的LB 平板上培養(yǎng)過夜；
[0016] 隨機挑取300個克隆，用堿裂解法提取粘粒，并用引物：pCCIF :5'-GGATGTGCTGCAA GGCGATTAAGITGG-3' 以及pCClR :5'-CTCGTATGITGTGTGGAAITGTGAGC-3'對所有粘粒進行末端 測序；根據(jù)粘粒末端測序分析，從中選取多組5粘粒組合，其中每組的5個重組粘粒均克隆 有馬立克氏病病毒弱毒疫苗814株基因組DNA片段，能相互重疊并可拼接覆蓋完整MDV基 因組；
[0017] 提取所選擇的粘粒DNA，對提取的粘粒進行線性化處理，將線性化后的分別含有馬 立克氏病病毒弱毒疫苗814株基因組DNA片段的5個粘粒組合轉染次代CEF細胞，轉染后 4h用15% (v/v)的甘油休克，休克后12h換含3% (v/v)胎牛血清，1% (v/v)雙抗（100U/ ml青霉素+100 y g/ml鏈霉素）的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)4-6天，觀察細胞病變情況；
[0018] 3)拯救毒rMDV的鑒定
[0019] 選取重復性較好的5粘粒組合，收取轉染后出現(xiàn)細胞病變的細胞；進行透射電鏡 檢測，觀察感染細胞的細胞核和細胞質(zhì)中存在的MDV病毒；提取病毒全基因組DNA，對拯救 毒rMDV和原馬立克氏病病毒弱毒疫苗814株的基因組進行酶切鑒定；對拯救毒rMDV主要 結構蛋白基因以及5粘粒結合部位進行測序，并與原病毒基因組序列進行比對，得到拯救 病毒rMDV的基因序列與原病毒完全一致的5粘粒組合。
[0020] MDV是一種嚴格的細胞結合性病毒，提取純度較高的MDV基因組DNA十分困難。為 了獲得純度較高的MDV基因組DNA用于Fosmid文庫的構建，本發(fā)明在用細胞透化液和細胞 核緩沖液破碎細胞的基礎上，加入微球菌核酸酶以降解細胞DNA(而病毒DNA因核衣殼的保 護不會被降解），與傳統(tǒng)方法相比，提高了所提取的病毒基因組DNA的純度。另外，在提取過 程中，本發(fā)明采用了高轉速離心（32000rpm)以使病毒粒子得到更好的沉淀，與傳統(tǒng)方法采 用的低轉速（3500rpm)相比，提高了病毒基因組DNA的獲取量。
[0021] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的提取病毒基因組DNA是按照以下方法進行：將感染 細胞反復凍融三次，將細胞和上清于32000rpm離心45min，棄上清；將沉淀用10mL細胞透 化液重懸，冰浴lOmin ;32000rpm離心45min，棄上清；將沉淀再次用細胞透化液重懸，冰浴 lOmin ;32000rpm離心45min，棄上清；將沉淀用5mL細胞核緩沖液重懸，加入500 y L 10 X 核酸酶緩沖液、50 y L 100XBSA、600U微球菌核酸酶和1 y L 100mg/ml的RNase A，混勻， 37°C作用lh ;加入55yL 0. 5M EDTA，37°C作用5min ;加入22mL裂解緩沖液和135yL濃度 為20mg/mL的蛋白酶K，50°C作用16h ;將裂解產(chǎn)物用等體積酚-氯仿-異戊醇抽提兩次， 氯仿抽提一次，每次8000rpm離心5min，取上層清液；加入1/10體積的3M醋酸鈉和2倍體 積無水乙醇， -20°C沉淀2h;15000g離心15min，棄上清；向沉淀加入lmL 70% (v/v)乙醇， 15000g離心10min，棄上清；將沉淀風干后用pH 7. 5100 y L Tris-HCl溶解，即得；
[0022] 其中，所述的細胞透化液為含有320mM蔗糖，5mM MgCl2，l% (v/v)Triton X-100的 10mM Tris-HCl, pH 7. 5 ；
[0023] 所述的細胞核緩沖液為含有2mMMgCl2 ? 6H20以及10% (w/v