Iba1和LAG-3雙基因共表達(dá)重組腺病毒載體及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及Ibal和LAG-3雙基因共表達(dá)重組腺病毒載 體，還涉及該載體的制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 腦出血（Intracerebralhemorrhage，ICH)為常見(jiàn)的急性腦血管病，其發(fā)病率、病 死率和致殘率高，在我國(guó)發(fā)病率有逐年上升的趨勢(shì)。ICH后顱內(nèi)血腫形成是導(dǎo)致神經(jīng)損傷最 重要的病理。血腫主要成分及紅細(xì)胞裂解產(chǎn)物誘發(fā)的炎癥反應(yīng)、血腫周?chē)x異常、局部腦 血流量變化等是導(dǎo)致繼發(fā)性神經(jīng)損傷加重的主要原因。目前認(rèn)為血腫成分激發(fā)的炎癥反應(yīng) 在繼發(fā)性神經(jīng)損傷中具有重要作用而備受關(guān)注。ICH后血腫周?chē)∧z質(zhì)細(xì)胞等炎性細(xì)胞激 活，釋放TNF-a、IL-1等致炎因子，加之血腦屏障破壞，外周血單核巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞向 血腫周邊區(qū)聚集，由此誘發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)，最終導(dǎo)致繼發(fā)性腦損傷和神經(jīng)功能缺損加 劇。因此，抑制腦出血后小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，可以有效控制腦出血后的神經(jīng)功能損傷。
[0003] 鈣離子作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通道中的第一信使，在所有細(xì)胞包括中樞神經(jīng)細(xì)胞的生命 活動(dòng)中起重要作用。媽離子與不同的媽結(jié)合蛋白結(jié)合后進(jìn)行級(jí)聯(lián)反應(yīng)。Ibal (ionized calcium binding adapter molecule 1)是能與巨細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合的 鈣結(jié)合蛋白，當(dāng)這些細(xì)胞激活后，Ibal的表達(dá)量上調(diào)，因此Ibal通常作為鑒定小膠質(zhì)細(xì)胞 的標(biāo)記物使用。
[0004]淋巴細(xì)胞活化基因-3 (lymphocyte activation gene-3, LAG-3, CD223)是免疫球 蛋白超家族的成員之一，是對(duì)淋巴細(xì)胞具有抑制作用的分子。LAG-3定位于人12號(hào)染色體， 與CD4具有密切關(guān)系。研宄發(fā)現(xiàn)豬LAG-3分子的結(jié)構(gòu)和表達(dá)模式在哺乳動(dòng)物物種中是共有 的，并且可溶性的豬LAG-3對(duì)控制人-豬異種T細(xì)胞免疫反應(yīng)有作用。LAG-3分子主要表 達(dá)于活化的NK細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞表面，與HLA-II高親和力結(jié)合。腫瘤浸潤(rùn)的CD8+T細(xì)胞表 面LAG-3表達(dá)上調(diào)，LAG-3的抑制作用在HCC的細(xì)胞免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要的作用，可見(jiàn)阻 斷LAG-3分子的表達(dá)有可能成為治療腫瘤的新方法。此外，使用LAG-3毒性抗體選擇性的 靶向激活T細(xì)胞可阻礙T細(xì)胞參與的遲發(fā)型超敏反應(yīng)。
[0005] 基因聯(lián)合治療的方式主要有兩種：一是將多種分別攜帶不同基因的重組表達(dá)載體 同時(shí)轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞，這種方式可以自由調(diào)節(jié)各重組表達(dá)載體的比例，但需要分別構(gòu)建攜帶不 同基因的重組表達(dá)載體，構(gòu)建工作繁瑣、費(fèi)時(shí)，影響因素多；此外，由于轉(zhuǎn)染過(guò)程具有一定隨 機(jī)性，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞存在基因拷貝不均一的問(wèn)題，既不利于目的基因的表達(dá)及后續(xù)治療，又 導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果難于評(píng)估分析；上述缺點(diǎn)限制了此種方式的進(jìn)一步應(yīng)用。二是將兩個(gè)或兩個(gè) 以上的基因由一個(gè)載體攜帶表達(dá)，這種方式可以通過(guò)多啟動(dòng)子載體、多順?lè)醋虞d體或融合 基因等調(diào)控手段提高基因轉(zhuǎn)染效率，增加表達(dá)強(qiáng)度，并維持相對(duì)的表達(dá)比例，從而克服了前 一種方式的不足，近年來(lái)日益受到研宄者的重視。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供Ibal和LAG-3雙基因共表達(dá)重組腺病毒載 體；本發(fā)明的目的之二在于提供上述重組腺病毒載體的制備方法；本發(fā)明的目的之三在于 提供重組表達(dá)腺病毒載體在制備抗小膠質(zhì)細(xì)胞活化的藥物中的應(yīng)用；本發(fā)明的目的之四在 于提供利用權(quán)重組表達(dá)腺病毒載體包裝的重組腺病毒；本發(fā)明的目的之五在于提供重組腺 病毒在制備抗小膠質(zhì)細(xì)胞活化的藥物中的應(yīng)用。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0008]Ibal和LAG-3雙基因共表達(dá)重組腺病毒載體，所述重組腺病毒載體含有表達(dá)Ibal 和LAG-3的雙基因表達(dá)盒，所述雙基因表達(dá)盒依次由CMV啟動(dòng)子、LAG-3基因、內(nèi)部核糖體 進(jìn)入位點(diǎn)IRES、Ibal基因和終止子組成，所述LAG-3基因的核苷酸序列如SEQIDNO. 3所 示，所述Ibal基因的核苷酸序列如SEQIDNO. 6所示。
[0009] 優(yōu)選的，所述重組腺病毒載體是由含LAG-3基因、內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)IRES和 Ibal基因的片段通過(guò)Sal I酶切位點(diǎn)和Not I酶切位點(diǎn)連入pShuttle-CMV載體Sal I 酶切位點(diǎn)和Not I酶切位點(diǎn)之間，然后用Pme I酶切線(xiàn)性化再與pAdEasy-1載體在大腸桿 菌BJ902內(nèi)同源重組而得。
[0010] 優(yōu)選的，包括如下步驟：
[0011] a.克隆LAG-3基因和Ibal基因編碼區(qū)，然后將LAG-3基因編碼區(qū)插入pStar 載體的IRES上游，再I(mǎi)bal基因編碼區(qū)插入pStar載體的IRES下游，得重組載體 pStar-LAG-3-IRES-Ibal；
[0012] b?以重組載體pStar-LAG-3-IRES-Ibal為模板，SEQ IDNo.7和SEQ IDNo.8 所示序列為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得帶酶切位點(diǎn)的含有含LAG-3基因、內(nèi)部核糖體進(jìn)入位 點(diǎn)IRES和Ibal基因的片，然后將含LAG-3基因、內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)IRES和Ibal基 因的片插入腺病毒穿梭載體pShuttle-CMV的CMV啟動(dòng)子下游，得重組腺病毒穿梭載體 pShuttle-CMV-LAG-3-IRES-Ibal；
[0013]c.將重組腺病毒穿梭載體pShuttle-CMV-LAG-3-IRES-Ibal與腺病毒骨架載體 pAdEasy-1在大腸桿菌BJ902中進(jìn)行胞內(nèi)同源重組，得重組腺病毒載體pAd-LAG-3/Ibal。
[0014] 優(yōu)選的，步驟a中克隆LAG-3基因的方法如下：提取人肝組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到 cDNA，再以該cDNA為模板，以SEQIDNo. 1和SEQIDNo. 2所示序列為上下游引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，得LAG-3基因；所述PCR條件為94°C預(yù)變性5分鐘；然后94°C變性50秒，58°C退火 50秒，72 °C延伸2分鐘，共30個(gè)循環(huán)；最后72 °C延伸10分鐘。
[0015] 優(yōu)選的，步驟a中克隆Ibal基因的方法如下：提取人胰腺組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到 cDNA，再以該cDNA為模板，以SEQIDNo. 4和SEQIDNo. 5所示序列為上下游引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，得Ibal基因，所述PCR擴(kuò)增的條件為：94°C預(yù)變性5分鐘；然后94°C變性50秒，58°C 退火50秒，72 °C延伸2分鐘，共30個(gè)循環(huán)；最后72 °C延伸10分鐘。
[0016] 優(yōu)選的，步驟b中，擴(kuò)增LAG-3-IRES-Ibal的條件為94°C預(yù)變性5分鐘；然后94°C 變性50秒，58°C退火50秒，72°C延伸2分鐘，共30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘。
[0017] 3、所述重組表達(dá)腺病毒載體在制備抗小膠質(zhì)細(xì)胞活化的藥物中的應(yīng)用。
[0018] 4、利用所述重組表達(dá)腺病毒載體包裝的重組腺病毒。
[0019] 5、所述重組腺病毒在制備抗小膠質(zhì)細(xì)胞活化的藥物中的應(yīng)用。
[0020] 本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明公開(kāi)了Ibal和LAG-3雙基因共表達(dá)重組腺病毒載 體，其含有重組腺病毒載體含有表達(dá)Ibal和LAG-3的雙基因表達(dá)盒，該表達(dá)盒可以同時(shí)恒 定表達(dá)出Ibal和LAG-3蛋白，將重組腺病毒載體包裝為重組腺病毒，制成的重組腺病毒體 外轉(zhuǎn)染小膠質(zhì)細(xì)胞后，能夠抑制腦出血后的炎癥反應(yīng)，有效提高腦出血小鼠的神經(jīng)功能，并 延長(zhǎng)腦出血小鼠的生存期，可用于制備抗小膠質(zhì)細(xì)胞活化的藥物，并在腦血管病的治療領(lǐng) 域具有良好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。
【附圖說(shuō)明】
[0021] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖：
[0022] 圖1顯示了LAG-3全長(zhǎng)cDNAPCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（1泳道為DNA分子 量標(biāo)準(zhǔn)，2泳道為PCR產(chǎn)物）。
[0023] 圖2顯示了Ibal全長(zhǎng)cDNAPCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（1泳道為DNA分子 量標(biāo)準(zhǔn)，2泳道為PCR產(chǎn)物）。
[0024] 圖3顯示了westernblot檢測(cè)LAG-3和Ibal的表達(dá)結(jié)果（1為未轉(zhuǎn)染Ad-LAG-3/ Ibal病毒轉(zhuǎn)染小膠質(zhì)細(xì)胞；2為Ad-LAG-3/Ibal病毒轉(zhuǎn)染小膠質(zhì)細(xì)胞）。
[0025] 圖4顯示了小膠質(zhì)細(xì)胞增殖能力的檢測(cè)結(jié)果。
[0026] 圖5顯示了小膠質(zhì)細(xì)胞分泌細(xì)胞因子能力的檢測(cè)結(jié)果。
[0027] 圖6顯示了腦出血小鼠的腦水腫情況。
[0028] 圖7顯示了腦出血小鼠的神經(jīng)功能評(píng)分。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 下面將結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的