一種酯酶拆分(±)-扁桃酸甲酯的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于生物催化技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種酯酶拆分（±)-扁桃酸甲酯的方 法。
【背景技術(shù)】：
[0002] 扁桃酸及其衍生物的對映體是一類非常重要的藥物中間體，被廣泛應(yīng)用于多種藥 物的合成，如青霉素、頭孢菌素、環(huán)扁桃酯、抗腫瘤制劑、輔酶A等。光學(xué)純扁桃酸系列化合 物傳統(tǒng)制備工藝為化學(xué)合成外消旋產(chǎn)物后再進(jìn)行手性化學(xué)拆分，此方法試劑昂貴，污染環(huán) 境，且純度不高。生物催化法制備手性化合物是一類集生物技術(shù)與化學(xué)工程于一體的新興 方法，該方法具有效率高、選擇性強(qiáng)、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，是近年來科研人員研宄的重點(diǎn)和熱 點(diǎn)。其中，生物催化法制備光學(xué)純扁桃酸系列化合物基于所涉及催化劑種類的不同又可以 細(xì)分為3種：1)依賴于氧化還原酶體系催化法，2)腈水解酶催化法，3)酯酶/脂肪酶催化 法。Tsuchiya等利用氧化還原酶體系將外消旋的扁桃酸轉(zhuǎn)化成單一異構(gòu)體的R-扁桃酸， 產(chǎn)率達(dá)到75%，對映體過量值大于99%。李忠琴等人利用酵母菌的突變株轉(zhuǎn)化苯乙酮和苯 乙酮酸甲酯得到相應(yīng)的R構(gòu)型酸和酯，產(chǎn)率大于90%，對映體過量值均大于99%。其次， Yamamoto和Banerjee等人分別利用腈水解酶催化外消旋扁桃腈，均獲得較高的產(chǎn)率和對 映體過量值的R-扁桃酸。再有，Kim等人利用Pseudomonassp.細(xì)胞拆分（±)_扁桃酸， 獲得對映體過量值為99. 4%的R-扁桃酸。這些例子均體現(xiàn)生物催化法具有轉(zhuǎn)化效率高、 立體選擇性強(qiáng)的特點(diǎn)。其中，酯酶/脂肪酶是一類酯鍵水解酶，它可在油水界面催化長鏈甘 油三酸酯水解形成甘油二酯、甘油單酯或甘油及游離脂肪酸；而它在非水介質(zhì)中又能催化 酸的羧基與醇的羥基進(jìn)行脫水縮合反應(yīng)產(chǎn)生酯類化合物，如此獨(dú)特的性質(zhì)使其在多種反應(yīng) (水解反應(yīng)、酯化反應(yīng)、醇解反應(yīng)、酸解反應(yīng)等）中具有廣泛的應(yīng)用，并且備受關(guān)注。
[0003] 然而，目前報道的這些酶類大部分是優(yōu)先作用R構(gòu)型，通過水解或者轉(zhuǎn)化得到 R-扁桃酸，因此，有必要尋找和開發(fā)優(yōu)先作用S構(gòu)型的酶類，以制備S-扁桃酸和R構(gòu)型的扁 桃酸系列化合物，進(jìn)而研宄相應(yīng)的作用機(jī)理。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種酯酶拆分（±) _扁桃酸甲酯的方法，利用該方法能夠拆 分（±)_扁桃酸甲酯制備R-扁桃酸甲酯，其具有操作簡單，對環(huán)境友好，耗時少，產(chǎn)物得率 高，單一對映體光學(xué)純度高的優(yōu)點(diǎn)。
[0005] 本發(fā)明的酯酶拆分（±)_扁桃酸甲酯的方法，其特征在于，在酯酶EST04211存在 的情況下，對（±)_扁桃酸甲酯進(jìn)行水解，酯酶EST04211催化S-扁桃酸甲酯生成S-扁桃 酸，然后再將R-扁桃酸甲酯和S-扁桃酸進(jìn)行分離，所述的酯酶EST04211，其氨基酸序列如 SEQIDN0. 2 所示。
[0006] 所述的酯酶拆分（±)-扁桃酸甲酯的方法，具體步驟優(yōu)選如下：
[0007] 稱?。ā?_扁桃酸甲酯加入到反應(yīng)器中，再加入pH為6~10的反應(yīng)緩沖液和酯 酶EST04211形成反應(yīng)體系，在30~40°C下，酯酶EST04211催化S-扁桃酸甲酯生成S-扁 桃酸，然后用疏水性溶劑進(jìn)行萃取，從疏水性溶劑中得到R-扁桃酸甲酯。按照此方法進(jìn)行 拆分，R-扁桃酸甲酯的對映體過量值為>90 %，最高達(dá)到99. 9 %以上，產(chǎn)率最高接近90 %。
[0008] 進(jìn)一步優(yōu)選，在反應(yīng)體系中，反應(yīng)緩沖液的pH值為6~7,（±)_扁桃酸甲酯的初 始反應(yīng)濃度為5~40mM，酯酶EST04211用量為20yg/ml，反應(yīng)時間為1~2小時。
[0009] 所述的疏水性溶劑優(yōu)選為乙酸乙酯。
[0010] 本發(fā)明還提供了酯酶EST04211在拆分（±)_扁桃酸甲酯獲得R-扁桃酸甲酯中的 應(yīng)用，所述的酯酶EST04211，其氨基酸序列如SEQIDN0. 2所示。
[0011] 本發(fā)明的（±)-扁桃酸甲酯是指R-扁桃酸甲酯和s-扁桃酸甲酯的混合物。
[0012] 本發(fā)明與傳統(tǒng)的化學(xué)拆分相比，具有反應(yīng)條件溫和、無污染、對映體過量值高的優(yōu) 點(diǎn)；與目前報道的酶法催化拆分相比，所用酯酶EST04211優(yōu)先水解S構(gòu)型的扁桃酸甲酯得 到光學(xué)純的R-扁桃酸甲酯，立體選擇性強(qiáng)。所得產(chǎn)品可以簡單加以純化后用于相應(yīng)藥物的 合成。
【附圖說明】：
[0013] 圖1是酯酶EST04211催化（±)_扁桃酸甲酯水解的過程方程式；
[0014] 圖2是酯酶EST04211催化（±)_扁桃酸甲酯水解得到R-扁桃酸甲酯的GC分析 圖，圖2A是（±)-扁桃酸甲酯的GC分析圖，圖2B是R-扁桃酸甲酯標(biāo)樣的GC分析圖，圖2C 是S-扁桃酸甲酯標(biāo)樣的GC分析圖，圖2D是乙酸乙酯相中的GC分析圖，乙酸乙酯相中只含 有R-扁桃酸甲酯，而不含有S-扁桃酸甲酯和S-扁桃酸。
【具體實(shí)施方式】：
[0015] 以下實(shí)施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。
[0016] 本發(fā)明的酯酶EST04211，其氨基酸序列如SEQIDN0. 2所示，其編碼基因序列 如SEQIDNO. 1所示，該酯酶EST04211公開于專利申請?zhí)枮椋?01410333182. 4,發(fā)明名 稱為：一種新的酯酶及其編碼基因和應(yīng)用，公開號為：CN104140959A的專利申請中，酯酶 EST04211的制備方法見于該專利中，由此能夠獲得酯酶EST04211。
[0017] 實(shí)施例1 :
[0018] 1、不同溫度中酯酶EST04211水解拆分（±)_扁桃酸甲酯的影響分析，酯酶 EST04211催化（±)_扁桃酸甲酯水解的過程方程式如圖1所示。
[0019] 用100mM的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液（pH= 8. 0)配制一定量終濃度為10mM 的（±)_扁桃酸甲酯，按lml每管的體積分裝到10個EP管中，其中5個加入20yg酯酶 ￡5!'04211后分別置于10°〇、201：、301：、401：和501：的恒溫裝置下反應(yīng)，反應(yīng)111和211后各 分別取出500y1反應(yīng)樣品并加入終濃度為5mM的十二烷作為內(nèi)標(biāo)物，然后加入500y1乙 酸乙酯進(jìn)行萃取，酯酶EST04211催化S-扁桃酸甲酯生成S-扁桃酸，S-扁桃酸進(jìn)入水相， 乙酸乙酯相中得到R-扁桃酸甲酯（圖2所示，通過GC分析，乙酸乙酯相中只存在R-扁桃 酸甲酯，而不含有S-扁桃酸甲酯和S-扁桃酸，乙酸乙酯相中的R-扁桃酸甲酯可以通過蒸 餾的方法去除乙酸乙酯，而留下R-扁桃酸甲酯，如減壓濃縮去除乙酸乙酯，獲得R-扁桃酸 甲酯），乙酸乙酯相用氣相色譜進(jìn)行檢測。與此同時，另外5個EP管不加任何酶也分別置于 10 °C、20 °C、30 °C、40 °C和50 °C的恒溫裝置下作為對照實(shí)驗(yàn)。
[0020] 氣相色譜儀為福立GC-9790II，配備氫火焰離子化檢測器，以氮?dú)鉃檩d氣。手性色 譜柱為安捷倫產(chǎn)品112-6632CYCL0SIL-B(30mX0. 25mmID，0. 25ymdf)，進(jìn)樣器和檢測器溫 度分別為250°C和280°C，升溫程序?yàn)椋合?0°C保持1分鐘，然每分鐘升溫15°C至120°C保 持1分鐘，再每分鐘升溫l〇°C至200°C保持1分鐘。對映體過量值（e.e% )和得率（Y% ) 按照下列公式計算：
【主權(quán)項】
1. 一種酯酶拆分（±)_扁桃酸甲酯的方法，其特征在于，在酯酶EST04211存在的情況 下，對（±)_扁桃酸甲酯進(jìn)行水解，酯酶EST04211催化S-扁桃酸甲酯生成S-扁桃酸，然后 再對R-扁桃酸甲酯和S-扁桃酸進(jìn)行分離，所述的酯酶EST04211，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的酯酶拆分（±)_扁桃酸甲酯的方 法，具體步驟如下： 稱?。ā?_扁桃酸甲酯加入到反應(yīng)器中，再加入pH為6~10的反應(yīng)緩沖液和酯酶 EST04211形成反應(yīng)體系，在30~40°C下，酯酶EST04211催化S-扁桃酸甲酯生成S-扁桃 酸，然后用疏水性溶劑進(jìn)行萃取，從疏水性溶劑中得到R-扁桃酸甲酯。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，在反應(yīng)體系中，反應(yīng)緩沖液的pH值為6~ 7,（±)_扁桃酸甲酯的初始反應(yīng)濃度為5~40mM，酯酶EST04211用量為20 μ g/ml，反應(yīng)時 間為1~2小時。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的疏水性溶劑為乙酸乙酯。
5. 酯酶EST04211在拆分（±)_扁桃酸甲酯獲得R-扁桃酸甲酯中的應(yīng)用，所述的酯酶 EST04211，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種酯酶拆分(±)-扁桃酸甲酯的方法。它是在酯酶EST04211存在的情況下，對(±)-扁桃酸甲酯進(jìn)行水解，酯酶EST04211催化S-扁桃酸甲酯生成S-扁桃酸，然后再對R-扁桃酸甲酯和S-扁桃酸進(jìn)行分離，所述的酯酶EST04211，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本發(fā)明與傳統(tǒng)的化學(xué)拆分相比，具有反應(yīng)條件溫和、無污染、對映體過量值高的優(yōu)點(diǎn)；與目前報道的酶法催化拆分相比，所用酯酶EST04211優(yōu)先水解S構(gòu)型的扁桃酸甲酯得到光學(xué)純的R-扁桃酸甲酯和S-扁桃酸，立體選擇性強(qiáng)。所得產(chǎn)品可以簡單加以純化后用于相應(yīng)藥物的合成。
【IPC分類】C12P7-62, C12P41-00, C12N9-18, C12P7-42
【公開號】CN104830944
【申請?zhí)枴緾N201510212293
【發(fā)明人】胡云峰, 梁甲元, 孫愛君, 張云, 鄧盾
【申請人】中國科學(xué)院南海海洋研究所
【公開日】2015年8月12日
【申請日】2015年4月29日