一種應用blu-v pma技術(shù)快速判定奶及奶制品中副結(jié)核分枝桿菌存活狀態(tài)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明一種應用BLU-V PMA技術(shù)快速判定奶及奶制品中副結(jié)核分枝桿菌存活狀態(tài)的方法，屬于微生物檢測技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]副結(jié)核病(Para tuberculosi5.)是由副結(jié)核分枝桿菌，即鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種(Mycobac teriUtm viumsubsp.Para tuberculosis, MAP)引起的一種以反合動物為主的慢性消耗性傳染病，也稱Johne, s病。該病很難凈化，而且與人類的克羅恩氏(Crohn, s)病存在潛在的聯(lián)系，有研宄表明人的這種嚴重的疾病可能是由于奶的巴氏消毒法不能夠完全殺滅該菌，且研宄中發(fā)現(xiàn)幾乎44%的奶制品中都檢出副結(jié)核菌為陽性。隨著我國國民生活水平的不斷提高，牛奶需求量呈正指數(shù)增長，急需大量的優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)奶牛，促使近年來進口種牛驟增，迫切需要建立早期的快速、準確的副結(jié)核病診斷方法，以預防、凈化和根除該病，保護我國畜牧業(yè)的健康快速發(fā)展。
[0003]目前檢測副結(jié)核分枝桿菌的常見方法有細菌學診斷、免疫學診斷、分子生物學診斷。其中涂片鏡檢法不能鑒別出感染者體內(nèi)的病原菌是否存活，細菌培養(yǎng)法存在難于培養(yǎng)且耗時長至少4-6周，藥敏試驗也耗時比較長的問題。補體結(jié)合實驗(CF)雖然對有臨床癥狀的病畜檢出率較高，但用于潛伏感染病例時效果不佳。瓊脂擴散試驗(AGID)方法敏感性低，不宜用作篩選和鑒定亞臨床感染病例。酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)比較敏感，有希望作為常用的診斷法。近幾年，Nogva等人應用EMA-PCR技術(shù)來區(qū)分活菌和死菌。但是EMA具有一定的毒性，如果與細胞作用時間稍長就會嵌入活細胞的細胞膜與其DNA結(jié)合，從而影響，檢測結(jié)果。單疊氮丙啶(propidium mono azide, PMA)能夠通過細胞膜破損的死菌，與DNA結(jié)合，使死菌DNA在PCR時不再擴增，進而檢測活菌的信號。TomasGarcia-Cayuela[53]等利用PMA_qPCR方法對乳制品中的四種乳酸菌進行了定量檢測，PMA-PCR技術(shù)是目前最具應用前景的活菌檢測技術(shù)。目前未有人應用BLU-V PMA結(jié)合熒光定量PCR技術(shù)進行副結(jié)核分支桿菌的存活性的快速判定。
[0004]然而，光源類型也是影響PMA處理的一個重要因素，在以往實驗中對PMA進行處理時，所使用的光源都是600W的鹵素燈，雖然其造價合理，照明度充分，但是它達到峰值亮度的時間短，且受到空氣介質(zhì)和樣品濁度的影響，都會使PMA的處理效果降低，導致試驗出現(xiàn)假陽性和假陰性的結(jié)果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，所要解決的技術(shù)問題是將BLU-V系統(tǒng)作為光源應用于PMA技術(shù)中，結(jié)合熒光定量PCR技術(shù)的優(yōu)點，成功建立了一種快速檢測奶及奶制品中MAP活菌的方法。
[0006]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為:一種應用BLU-V PMA技術(shù)快速判定奶及奶制品中副結(jié)核分枝桿菌存活狀態(tài)的方法，將BLU-V系統(tǒng)作為光源應用于PMA技術(shù)中；
所述的將BLU-V系統(tǒng)作為光源應用于PMA技術(shù)判定奶及奶制品中副結(jié)核分枝桿菌存活狀態(tài)的方法包括如下步驟:
a取待測樣品，液體樣品直接離心，固體樣品加蒸餾水溶解離心，14500r離心5min ;離心完畢后，棄去上清，加入EBBufTer于沉淀中，混勻得菌懸液；
b向步驟a的菌液中加單疊氮丙啶，使單疊氮丙啶的終濃度為10yg/mL，充分混勾，并設(shè)不加PMA的菌懸液作為對照；將EP管置于避光盒中，避光1min ;取出EP管，將其放入BLU-V系統(tǒng)中(儀器的光強為100)，作用20min，使PMA與死菌的DNA雙鏈結(jié)合；每隔2min取出EP管在漩渦振蕩儀上振蕩混懸一次，以增加結(jié)合率；
c步驟b結(jié)束后，取出EP管，14500r離心5min ;離心完畢后，棄去上清(注意要棄充分)；最后加入400 μ L的TE，再次重懸混勻；后續(xù)進行常規(guī)的DNA提??；
d以步驟c中提取的DNA為模板，進行熒光定量PCR檢測樣品中的目標菌，上下游引物及探針序列分別為
上游:5，-AACGAGGGGACGATGAGG-Y 下游:5’ -CTGTGATGTAACGCGATTCG-3’
探針 5’ -FAM-CACGGCGTTGCTGATGTCCACC-TAMRA
熒光定量 PCR 反應體系為 10XPCRBuffer500mM, Kcl, lOOmMTris-cl (pH8.3)室溫下2.5 yL, Mgcl225mMl.5 μ L，dATP, dCTP, dTTP, dGTP 各 3.2 ymol2.0 μ L，上下游引物 1pmol各 1.0 μ L，TaqDNA 酶 5U/ μ L2.5 yL，探針 3pmoll.0 yL，模板 DNA2.0 yL,ddH2011.5 yL，總反應體系25.0yLo
[0007]所述的一種應用BLU-V PMA技術(shù)快速判定奶及奶制品中副結(jié)核分枝桿菌存活狀態(tài)的方法，熒光定量PCR反應條件:93°C變性15s ;56°C退火15s，68°C延伸30s，40個循環(huán)。
[0008]所述的一種應用BLU-V PMA技術(shù)快速判定奶及奶制品中副結(jié)核分枝桿菌存活狀態(tài)的方法，確定TaqMan熒光定量PCR檢測的Ct值< 25時，結(jié)果判定為陽性；與未經(jīng)PMA處理組相比，PMA處理后的Ct值比未經(jīng)PMA處的Ct值要大于6個以上，判定奶樣中不含有活菌。
[0009]與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明具有以下有益效果。
[0010]與以往PMA進行處理時所使用的光源都600W的鹵素燈相比，而本發(fā)明所使用的BLU-V系統(tǒng)是一種能夠持續(xù)生成穩(wěn)定光刺激量的激光熱穩(wěn)定設(shè)備，即該設(shè)備具有特定的波長和持續(xù)穩(wěn)定的激光照射強度，它可以將檢測樣品置于密閉空間中同時對12份經(jīng)過PMA處理的樣本進行光化激活反應。不僅避免了空氣介質(zhì)及樣品濁度的影響，而且提高了樣品檢測的效率。
[0011]本發(fā)明使用BLU-V系統(tǒng)，結(jié)合PMA和熒光定量PCR技術(shù)的優(yōu)點，成功建立了一種快速檢測奶及奶制品中姻巧舌菌的方法。該方法操作簡單，快速且比較精確。并使之成為奶及奶制品是否符合生物安全的一個重要指標，對預防、凈化和清除該病，保護我國人民生命安全與畜牧業(yè)的健康快速發(fā)展具有重要的意義。
【附圖說明】
[0012]圖1為實施例1中的熒光定量擴增圖譜；
圖2實施例2中不同光照時間處理所對應的熒光定量ct值；
圖3實施例2中不同質(zhì)量濃度PMA處理所對應的熒光定量ct值；
圖4實施例3經(jīng)PMA處理及無PMA處理的MAP標準菌株P(guān)18熒光定量擴增圖譜；
圖5實施例3經(jīng)PMA處理及無PMA處理的MAP標準菌株P(guān)18熒光定量Ct值報告；
圖6實施例3經(jīng)PMA處理及無PMA處理的MAP標準菌株P(guān)lO熒光定量擴增圖譜；
圖7實施例3經(jīng)PMA處理及無PMA處理的MAP標準菌株P(guān)lO熒光定量Ct值報告。
【具體實施方式】
[0013]以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。
[0014]實施例1
引物特異性驗證
提取Map (P10和P18)、金黃色葡萄球菌，沙門氏菌，大腸桿菌，草分枝桿菌6種標準菌株基因組DNA，進行TaqMan熒光定量PCR擴增，檢測本發(fā)明方法的特異性。(副結(jié)核分枝桿菌(JiparaiMercWo1Si1S)標準菌株:P18 (美國)，P10 (日本)(都為牛型副結(jié)核標準菌株)，均由吉林獸醫(yī)研宄所提供。金黃色葡萄球菌，沙門氏菌，大腸桿菌，草分枝桿菌均由山西出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心實驗室保存。)
1.DNA的制備
取50 μ L菌液，加入400 UL TE中，混勻。提取DNA模板的具體步驟如下:
(1)80°0水浴加熱20 min，冷卻至室溫，使之滅活；
(2)加50y L溶菌酶，37 °C氣浴震蕩培養(yǎng)I h;
(3)加75yL SDS/蛋白酶K，混勻，65 °〇水浴加熱10 min ；
(4)加100 yL 5 mol/L 的 Nacl 和 100 μ L 65 °C 預熱 5 min 的 CTAB/Nacl，上下顛倒混勻，直至液體變?yōu)榘咨?奶狀)，65 °0水浴加熱10 min ；
(5)加750UL三氯甲烷:異戊醇(24: 1)，混勻，12000 r/min，室溫離心5 min ;
(6)取上層水相(上清)于新管中，加等體積的三氯甲烷:異戊醇(24: 1)，混勻，12000r/min，室溫離心5 min ；
(7)取上層水相于新管中，小心加入0.6體積的異丙醇，沉淀核酸，小手搖混勻，-20 0C放置 30 min，12000 r/min，室溫離心 15 min ；
(8)棄上清，加入500μ L預冷的70%的乙醇，12000 r/min，室溫離心5 min,；
(9)小心吸走液體，室溫下干燥10min左右，用50 yL TE溶解，4 °C保存。
[0015]2.TaqMan熒光定量PCR反應體系及循環(huán)條件
熒光定量 PCR 反應體系為 10XPCRBuffer500mM, Kcl, lOOmMTris-cl (pH8.3)室溫下2.5 yL, Mgcl225mMl.5 μ L，dATP, dCTP, dTTP, dGTP 各 3.2 ymol2.0 μ L，上下游引物 1pmol各 1.0 μ