海洋沉積物有機污染快速監(jiān)測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及屬于環(huán)境監(jiān)測領(lǐng)域，特別涉及一種基于海洋微生物16S基因片段的海 洋沉積物有機污染快速監(jiān)測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 有機污染物是指以碳水化合物、蛋白質(zhì)、氨基酸以及脂肪等形式存在的天然有機 物質(zhì)及某些其他可生物降解的人工合成有機物質(zhì)為組成的污染物，可分為天然有機污染 物和人工合成有機污染物兩大類。有機污染物具有高毒性、持久性以及生物富集效應(yīng)等特 點，自然界中廣泛存在的有機污染已成為人類亟需解決的重要環(huán)境問題之一。有機氯農(nóng)藥 (Organochlorinepesticides，OCPs)和多氯聯(lián)苯（Polychlorinatedbiphenyls，PCBs)是 毒性較高的持久性有機污染物，可長期存在于環(huán)境中，通過食物鏈積聚，對人類健康及環(huán)境 造成不利影響。有機氯農(nóng)藥和多氯聯(lián)苯同是斯德哥爾摩公約首批控制的12種持久性有機 污染物之一，具有難降解性、生物毒性、生物富集性、遠(yuǎn)距離迀移性等危害性，是最具有代表 性、最難處置的危險廢物之一。有機氯農(nóng)藥是我國最早大規(guī)模使用的農(nóng)藥，20世紀(jì)80年代 初達(dá)到高峰，自1983年起禁止生產(chǎn)和使用。我國于2001年簽署了德哥爾摩公約，并制定了 《中國履行斯德哥爾摩公約國家實施計劃》，提出到2015年要完成已識別高風(fēng)險在用含多氯 聯(lián)苯裝置的環(huán)境無害化管理，2025年前要消除所有含多氯聯(lián)苯的設(shè)備及其污染物。長期以 來，我國對海洋環(huán)境中持久性有機污染物的監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，這兩類有機污染物普遍存在于我國 近岸、河口沉積物中。
[0003] 有機氯農(nóng)藥是一類高效殺蟲劑，廣泛應(yīng)用于殺滅農(nóng)業(yè)害蟲，這類農(nóng)藥化學(xué)性質(zhì)穩(wěn) 定，脂溶性強，殘效期長，易在脂肪體內(nèi)蓄積，造成慢性中毒，嚴(yán)重危及人體健康。常用的有 機氯農(nóng)藥多表現(xiàn)為：蒸汽壓低，揮發(fā)性小，所以使用后消失緩慢；氯苯結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定，不易 為生物體內(nèi)酶系降解，所以積存在動、植物體內(nèi)的有機氯農(nóng)藥分子消失緩慢；某些種類能懸 浮水層表面，在水氣界面上可隨水分子一起蒸發(fā)，從而擴散至沒有使用過該種類化合物的 區(qū)域；一般是疏水性的脂溶性化合物，在水中溶解度低。這些性質(zhì)使有機氯農(nóng)藥在土壤中不 可能大量地向地下層滲漏流失，而能較多地被吸附于土壤、沉積物顆粒，尤其是在有機質(zhì)含 量豐富的環(huán)境中，滯留期可長達(dá)數(shù)年。
[0004] 多氯聯(lián)苯是一組由多個氯原子取代聯(lián)苯分子中氫原子而形成的氯代芳烴類的持 久性有機污染物類物質(zhì).一般不溶于水，易溶于脂溶性物質(zhì)或吸附于顆粒物表面。由于其 具有良好的絕緣性、抗熱性、不可燃燒和高介電常數(shù)等優(yōu)點，被廣泛用作蓄電池、潤滑劑、變 壓器的絕緣介質(zhì)、壓敏復(fù)寫紙以及油墨和墨水等產(chǎn)品的添加劑。含多氯聯(lián)苯產(chǎn)品的使用以 及報廢電力變壓器及電容器等的封存、運輸、拆卸等過程中的釋放成為我國環(huán)境中多氯聯(lián) 苯污染的重要來源，進(jìn)入環(huán)境中的多氯聯(lián)苯最終貯存所主要是河流、海洋水體的底泥，只有 很少部分通過生物作用和光解作用發(fā)生轉(zhuǎn)化。
[0005] 海洋微生物泛指以海洋水體為正常棲居環(huán)境的一切微生物。與陸地相比，海洋環(huán) 境以高鹽、高壓、低溫和稀營養(yǎng)為特征。海洋微生物長期適應(yīng)復(fù)雜的海洋環(huán)境而生存，因而 有其獨具的特性，如嗜鹽性、嗜壓性、嗜冷性、低營養(yǎng)性、趨化性與附著生長、多形性和發(fā)光 性等。海洋微生物群落結(jié)構(gòu)的組成受到周圍環(huán)境的生物地球化學(xué)和生態(tài)學(xué)特征，諸如營養(yǎng) 物質(zhì)的循環(huán)、食物網(wǎng)的動態(tài)變化以及有機和無機物的含量變化等因素的影響。由于海洋微 生物富變異性，故能參與降解各種海洋污染物或有毒物質(zhì)，這有助于海水的自凈化和保持 海洋生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定，因此，微生物群落本身的組成和結(jié)構(gòu)變化也能反映水體環(huán)境中的化 學(xué)物質(zhì)含量與分布特點，目前已有研宄將發(fā)光細(xì)菌作為檢測水域污染狀況的指示菌。
[0006] 當(dāng)前對海洋污染進(jìn)行監(jiān)測常規(guī)的方法主要為理化檢測即采集海水、沉積物或海洋 生物樣品，利用現(xiàn)代儀器對各類海洋污染進(jìn)行定量檢測。理化檢測只能對海洋污染狀況進(jìn) 行局部的、瞬時的反映，無法反映海洋的整體污染效應(yīng)。同時，理化監(jiān)測只能檢知各種污染 物的含量和類別，如果發(fā)生未知污染物污染、生物污染或者大規(guī)?；旌衔廴緯r，各種污染物 之間既有協(xié)同作用，又有拮抗作用，以及相加作用等，其無法準(zhǔn)確評估海洋環(huán)境遭受污染程 度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)與指示生物法的優(yōu)勢，直接把有機污染物 (有機氯農(nóng)藥、多氯聯(lián)苯）與其指示微生物（CandidatedivisionWS3、Tenericutes)對應(yīng) 起來，實現(xiàn)了對海域復(fù)雜有機物污染環(huán)境的快速準(zhǔn)確監(jiān)測，不僅可以甄別綜合有機污染環(huán) 境中的關(guān)鍵污染物類別，還可以預(yù)測污染綜合效應(yīng)對微生物群落，乃至生態(tài)系統(tǒng)的影響。
[0008] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0009] 海洋沉積物有機污染物快速監(jiān)測方法，其特征在于，包括以下步驟：
[0010] 1)提取沉積物環(huán)境總DNA;
[0011] 2)采用引物擴增16SrDNA片段；所述引物序列為：
[0012] 27F:5' -AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3' ；其中M為A或C;(SEQIDNO. 1)
[0013] 1492R:5' -TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3' ；其中Y為C或T;(SEQIDNO. 2)
[0014] 3)克隆并測定DNA序列；將所得DNA序列與CandidatedivisionWS3的16S DNA(SEQIDNO. 3)和Tenericutes的 16SDNA(SEQIDNO. 4)序列對比：
[0015]SEQIDNO. 3：CTCCTACGGGAGGCAGCAGTCGAGAGGCTTCGGCAATGGGGGAAACCCTGACCGAGC GACGCCGCGTGGGTGATGAAGATCCTCGGATCGTAAAACCCTGTCAGGTGGGATGAAACCTCATTCGGCTAATACCC GAGTGACTTGACAGTACCACCAGAGGAAGCTCCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAACACGGGGGGAGCAAG CGTTGTTCGGATTTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTCCGTAAGTCAGAGGTGAAAGGTCACGGCTCAACCG TGGGAACGCCTTTGAAACTACAGAGCTTGAGGCCGGGAGAGGAAAGTGGAATTCCTGGAGTAGCGGTGAAATGCGTA GATATCAGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGACCGGTTCTGACGCTGAGGAGCGAAAGCTAGGGGAGC AAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCTAGCCGTAAACGATGGGCACTAGGTGTGGGGGGATCGACCCCTTCCGTGC CGCAGTTAACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGG；
[0016]SEQID.NO. 4：CTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATTTTCGGCAATGGGGGCAACCCTGACCGAGC AATGCCGCGTGAATGAAGAAGGTCTTCGGATCGTAAAATTTTGTTGTTAGGGAAGAATAGTAGATATAGGAAATGAT ATCTATGTGACGGTACCTAACTAGAAAGCTCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGAGCGAGC G