鼠傷寒沙門氏菌特異性lamp引物組及l(fā)amp檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種快速檢測沙門氏菌（Salmonella)的LAMP試劑盒，屬于微生物檢 測領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 沙門氏菌屬（Salmonella)是引起細(xì)菌性食物中毒的重要病原體之一，也是腸桿 菌科中最復(fù)雜的菌屬，屬革蘭氏陰性菌。目前全世界已分離出2523個血清型，我國已發(fā)現(xiàn) 216個。沙門氏菌的多種血清型可以引起中毒，以鼠傷寒沙門菌、豬霍亂沙門菌和腸炎沙門 菌最常見。沙門氏菌中毒的癥狀主要由急性腸胃炎為主，潛伏期一般為四至四十八小時，短 期是數(shù)小時，長期是兩天至三天，前期癥狀有惡心、頭疼，全身乏力和發(fā)冷等，主要癥狀有嘔 吐、腹瀉、腹疼，糞便以黃綠色水樣便，有時帶膿血和黏液，一般發(fā)熱的溫度在三十八攝氏度 至四十?dāng)z氏度，重病人出現(xiàn)打寒戰(zhàn)、驚厥、抽搐和昏迷的癥狀。
[0003] 傳統(tǒng)檢測沙門氏菌的培養(yǎng)方法，需要分離、培養(yǎng)和生化鑒定，必要時還需要血清學(xué) 鑒定，一般檢測周期為4~6d，費(fèi)時費(fèi)力，且靈敏度低、特異性差。PCR方法具有敏感性強(qiáng)、 特異性高、簡便、快速等優(yōu)點(diǎn)，已有較多應(yīng)用于沙門氏菌檢測的報道，但由于存在PCR后處 理產(chǎn)生污染導(dǎo)致的假陽性等問題以及需要特殊的儀器設(shè)備而限制了其在基層單位的應(yīng)用。 因此急待開發(fā)精確、靈敏、快速、無污染的臨床病原微生物檢驗(yàn)方法。
[0004]環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)技術(shù)是一種 新的等溫核酸擴(kuò)增方法，該法針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計4條特異引物，利用一種具有鏈置 換活性的DNA聚合酶（BstDNA聚合酶），在恒溫條件下即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)，產(chǎn)生肉眼可 見的反應(yīng)副產(chǎn)物-白色焦磷酸鎂沉淀。該技術(shù)具有不需要PCR儀、肉眼可判斷結(jié)果、反應(yīng)時 間短，特異性強(qiáng)，靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，特別適合病原微生物的檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何快速、準(zhǔn)確、特異性高地檢測鼠傷寒沙門氏菌。 為了解決該技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種特異性檢測鼠傷寒沙門氏菌的LAMP引物組、試劑 盒，以及利用LAMP引物和試劑盒檢測鼠傷寒沙門氏菌的LAMP方法。
[0006] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提出以下技術(shù)方案：
[0007] 本發(fā)明提供一種鼠傷寒沙門氏菌特異性LAMP檢測引物組，具體地，所述引物組包 括兩條外引物和兩條內(nèi)引物，所述引物組能夠擴(kuò)增鼠傷寒沙門氏菌限制酶II基因。
[0008] 本發(fā)明所述的鼠傷寒沙門氏菌特異性LAMP檢測引物組，其特征在于所述引物的 序列如下：
[0009]F3：CGATAATTTCATCTTCAATTTCTGG
[0010]B3:CGTGAGATATCGTCCAAAAGG
[0011]FIP：GCACTCCGGTTGTAAACCATTATTT-GTACTGAGGCTAATTCACCAC
[0012] BIP：AGCGTAAAGCAACTCATTTTTGTT-GTTTGTTTTTGATGATACAGGC〇
[0013] 另一方面，本發(fā)明提供一種鼠傷寒沙門氏菌特異性LAMP檢測試劑盒，具體地，所 述試劑盒包含本發(fā)明所述引物組。
[0014] 進(jìn)一步地，所述試劑盒包括BstDNA聚合酶大片段、LAMP10Xbuffer、6mol/L甜 菜喊、4mol/LdNTP、SYBR_Green染料。
[0015] 進(jìn)一步地，所述試劑盒中還包括陰性對照和/或陽性對照。
[0016] 進(jìn)一步地，所述陰性對照為PET28空載體質(zhì)粒，所述陽性對照為插入了鼠傷寒沙 門氏菌限制酶II基因的重組T載體。
[0017] 再一方面，本發(fā)明提供一種使用所述引物組或試劑盒特異性檢測鼠傷寒沙門氏菌 的LAMP方法。
[0018] 進(jìn)一步地，本發(fā)明提供一種使用所述引物組或試劑盒特異性檢測鼠傷寒沙門氏菌 的非診斷且非治療目的的LAMP方法。
[0019] 進(jìn)一步地，所述LAMP反應(yīng)體系中dNTP的終濃度為0. 2-0. 6mol/L、甜菜堿的終濃度 為0. 4-1. 2mmol/L，優(yōu)選地，dNTP的終濃度為0. 4mmol/L，甜菜堿濃度為0. 4-1. 2mmol/L，更 優(yōu)選地，dNTP的終濃度為0. 4mmol/L，甜菜堿濃度為0. 6-0. 8mol/L，最優(yōu)選地，dNTP的終濃 度為0? 4mmol/L，甜菜堿濃度為0? 6mol/L〇
[0020] 進(jìn)一步地，所述LAMP反應(yīng)在60_65°C恒溫下進(jìn)行45_75min，優(yōu)選地，在63°C恒溫 下反應(yīng)45-75min，更優(yōu)選地，在63°C恒溫下反應(yīng)50-65min，最優(yōu)選地，在63°C恒溫下反應(yīng) 60min〇
[0021] 本發(fā)明提供的快速檢測沙門氏菌LAMP試劑盒可對沙門氏菌進(jìn)行檢測，適應(yīng)于在 基層獸醫(yī)疾病防控機(jī)構(gòu)或普通養(yǎng)殖場推廣。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果：
[0022] 靈敏度高、特異性好，能夠快速準(zhǔn)確的鑒定樣本中的鼠傷寒沙門氏菌。
[0023] 檢測要求的設(shè)備條件低，結(jié)果直觀，肉眼觀察即可判斷。
【附圖說明】
[0024]圖1 :最佳水浴溫度的優(yōu)化。各泳道分別為：1、2000bpDNAMarker2、60 °C; 3、61 °C; 4、62°C;5、63°C;6、64°C;7、65°C;8、陰性對照。當(dāng)水浴溫度在63°C時條帶最亮。
[0025]圖 2 :最佳dNTPs濃度的優(yōu)化。各泳道分別為：l、2000bpDNAMarker;2、0. 2mmol/ L;3、0. 4mmol/L;4、0. 6mmol/L;5、0. 8mmol/L;6、1.Ommol/L;7、陰性對照。dNTPs濃度在 0. 4mmol/L時擴(kuò)增條帶最亮。
[0026] 圖3 :適宜反應(yīng)時間的優(yōu)化。各泳道分別為：l、2000bpDNAMarker;2、15min;3、 30min;4、45min;5、60min;6、75min;7、陰性對照。水浴時間為60min時條帶最亮。
[0027] 圖4 :甜菜堿最佳終濃度的優(yōu)化。各泳道分別為：l、2000bpDNAMarker;2、0. 2mol/ L;3、0. 4mol/L;4、0. 6mol/L;5、0. 8mol/L;6、1.Omol/L;7、1. 2mol/L;8、陰性對照。betaine 濃度在〇. 6mol/L時擴(kuò)增條帶最亮。
[0028] 圖5 ;本發(fā)明LAMP方法與PCR檢測靈敏度對比：圖5A為LAMP檢測結(jié)果，泳道1為 2000bpDNAMarker，泳道2-11是將模板分別稀釋10°-109,泳道12為陰性對照；圖5B為PCR 檢測結(jié)果，泳道1為2000bpDNAMarker，泳道2-11是將模板分別稀釋10°-109泳道12為陰 性對照。
[0029] 圖6 :LAMP產(chǎn)物加入SYBR-GreenI的熒光檢測結(jié)果。管1-10為模板分別稀釋 10°-109;管11為陰性對照。
[0030]圖7 :特異性試驗(yàn)。各泳道分別為：l、2000bpDNA Marker ;2、鼠傷寒沙門氏菌；3、綠 膿桿菌；4、金黃色葡萄球菌；5、副豬嗜血桿菌；6、副雞嗜血桿菌；7、巴氏桿菌；8、乳酸桿菌； 9、陰性對照。說明發(fā)明所述方法特異性好，能夠從獸醫(yī)臨床常見的致病菌中特異性檢測出 鼠傷寒沙門氏菌。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 以及結(jié)合具體實(shí)施實(shí)例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施實(shí)例僅用于說明 本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
[0032] 實(shí)施例1 :模板提取、引物設(shè)計、LAMP擴(kuò)增條件。
[0033] 提取鼠傷寒沙門氏菌DNA，其中提取的樣品DNA，其DNA0D260/0D280在1. 6-2. 0 范圍內(nèi)，濃度在l〇-l〇〇ng/ y L范圍內(nèi)。
[0034]根據(jù)鼠傷寒沙門氏菌限制酶II基因序列（如SEQ ID N0:9)，設(shè)計兩組LAMP引物， 序列如下：
[0035]第一組（SEQ ID N0:l_4):
[0036] F3-1 ：CGATAATTTCATCTTCAATTTCTGG
[0037] B3-1 ：CGTGAGATATCGTCCAAAAGG
[0038] FIP-1 ：GCACTCCGGTTGTAAACCATTATTT-GTACTGAGGCTAATTCACCAC
[0039] BIP-1 ：AGCGTAAAGCAACTCATTTTTGTT-GTTTGTTTTTGATGATACAGGC
[0040]第二組（SEQ ID NO:5-8):
[0041] F3-2 ：GGATATGGTACTGAGGCTAA
[0042] B3-2 ：CGTGAGATATCGTCCAAAAGG
[0043] FIP-2 ：GCACTCCGGTTGTAAACCATTAT-CACCACTAGTAAAGCTAAGTGT
[0044] BIP-2 ：AGCGTAAAGCAACTCATTTTTGTT-GTTTGTTTTTGATGATACAGGC
[0045] 合成上述兩組LAMP引物，每組設(shè)三個重復(fù)，利用常規(guī)LAMP程序進(jìn)行擴(kuò)增。
[0046] 擴(kuò)增體系如下所示：
[0047] 鼠傷寒沙門氏菌LAMP反應(yīng)體系（25yL)
[0048]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種鼠傷寒沙門氏菌特異性LAMP檢測引物組，其特征在于所述引物組包括兩條外 弓丨物和兩條內(nèi)引物，所述引物組能夠擴(kuò)增鼠傷寒沙門氏菌限制酶II基因。
2. 如權(quán)利要求1所述的鼠傷寒沙門氏菌特異性LAMP檢測引物組，其特征在于所述引物 組的序列為： F3-1 ：CGATAATTTCATCTTCAATTTCTGG B3-1 ：CGTGAGATATCGTCCAAAAGG FIP-I ：GCACTCCGGTTGTAAACCATTATTT-GTACTGAGGCTAATTCACCAC BIP-I ：AGCGTAAAGCAACTCATTTTTGTT-GTTTGTTTTTGATGATACAGGC〇
3. -種鼠傷寒沙門氏菌特異性LAMP檢測試劑盒，其特征在于所述試劑盒包含所述引 物組。
4. 如權(quán)利要求3所述試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括Bst DNA聚合酶大片段、 LAMP 10Xbuffer、6mol/L 甜菜喊和 4mol/L dNTP〇
5. 如權(quán)利要求3或4所述試劑盒，其特征在于所述試劑盒中還包括陰性對照和/或陽 性對照，優(yōu)選地，所述試劑盒中還包括熒光染料。
6. 如權(quán)利要求5所述試劑盒，其特征在于所述陰性對照為PET28空載體質(zhì)粒，所述陽性 對照為插入了鼠傷寒沙門氏菌限制酶Π 基因的重組T載體，所述熒光染料為SYBR GREENI。
7. -種使用權(quán)利要求1-2所述引物組或權(quán)利要求3-6所述試劑盒特異性檢測鼠傷寒沙 門氏菌的LAMP方法。
8. 如權(quán)利要求7所述特異性檢測鼠傷寒沙門氏菌的LAMP方法，其特征在于所述LAMP 反應(yīng)體系中dNTP的終濃度為0. 2-0. 6mol/L、甜菜堿的終濃度為0. 4-1. 2mmol/L，優(yōu)選地， dNTP的終濃度為0. 4mmol/L，甜菜堿濃度為0. 4-1. 2mmol/L，更優(yōu)選地，dNTP的終濃度為 0. 4mmol/L，甜菜堿濃度為0. 6-0. 8mol/L，最優(yōu)選地，dNTP的終濃度為0. 4mmol/L，甜菜堿濃 度為 0. 6mol/L。
9. 如權(quán)利要求7或8所述特異性檢測鼠傷寒沙門氏菌的LAMP方法，其特征在于 60-65°C恒溫下反應(yīng)45-75min，優(yōu)選地，在63°C恒溫下反應(yīng)45-75min，更優(yōu)選地，在63°C恒 溫下反應(yīng)50_65min，最優(yōu)選地，在63°C恒溫下反應(yīng)60min。
【專利摘要】一種特異性檢測鼠傷寒沙門氏菌的LAMP引物、試劑盒，以及利用LAMP引物和試劑盒檢測鼠傷寒沙門氏菌的LAMP方法，所述LAMP引物及檢測方法針對鼠傷寒沙門氏菌限制酶II基因的片段。所述LAMP方法特異性好、靈敏度高、檢測要求的設(shè)備條件低、結(jié)果直觀、肉眼可視，能夠快速準(zhǔn)確的鑒定獸醫(yī)臨床樣本中的鼠傷寒沙門氏菌感染。
【IPC分類】C12N15-11, C12Q1-68, C12Q1-04
【公開號】CN104830988
【申請?zhí)枴緾N201510268125
【發(fā)明人】黃保華, 李俊, 時建立, 彭喆, 王莉莉, 朱曉琳, 郭立輝, 叢曉燕, 吳曉燕, 劉暢, 徐紹建
【申請人】山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所
【公開日】2015年8月12日
【申請日】2015年5月22日