一種檢測牛流行熱病毒的lamp方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及病原微生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種檢測牛流行熱病毒的LAMP方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 牛流行熱俗稱三日熱或暫時(shí)熱，是由牛流行熱病毒引起的一種急性、熱性傳染病。 主要侵害奶牛，黃牛次之，水牛很少發(fā)生。該病以發(fā)病急、傳播快、高熱、呼吸道炎癥、四肢關(guān) 節(jié)疼痛、行動(dòng)僵拘等為主要特征。本病在我國主要見于南方，如廣東、廣西、云南、貴州、湖 南、湖北、江西、江蘇等省區(qū)常發(fā)，尤其是夏末初秋、高溫季節(jié)較多發(fā)生。目前，在北方地區(qū)也 時(shí)有本病的流行，給我國養(yǎng)牛業(yè)造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。
[0003] -般根據(jù)牛流行病學(xué)特征，臨床癥狀和病理變化的特點(diǎn)，可以對該病做出初步診 斷。需要確診的，可以借助一些實(shí)驗(yàn)室檢測手段來進(jìn)行，如中和實(shí)驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合、ELISA、間 接免疫熒光實(shí)驗(yàn)來檢測血清中的特異性抗體，但大部分診斷技術(shù)程序繁瑣，檢測的效果也 不是很理想；另外也可以在發(fā)熱初期采血進(jìn)行病毒分離，或者用熒光定量PCR的方法檢測 特異性抗原，但是，這些檢測技術(shù)的靈敏性都不是很好，而且對實(shí)驗(yàn)條件和設(shè)備的要求比較 尚。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種專一性檢測牛流行熱病毒的LAMP引物。
[0005] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種檢測牛流行熱病毒的LAMP試劑盒。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過以下方案予以實(shí)現(xiàn)的： 一種檢測牛流行熱病毒的LAMP引物，由外引物對F3/B3和內(nèi)引物對FIP/BIP組成，弓丨 物的序列如SEQIDN0:l~4所示。
[0007] 現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)存在很多檢測其他病原物的LAMP引物，但是，對于牛流行熱病毒 一直都沒有，原因在于，牛流行熱病毒（BEFV)和牛赤羽病病毒（AKV)、牛傳染性支氣管炎病 毒（IBRV)、牛病毒性腹瀉病毒（BVDV)很相似，在檢測的時(shí)候很容易出現(xiàn)交叉反應(yīng)，所以，要 想設(shè)計(jì)一組專一性檢測牛流行熱病毒的LAMP引物非常的困難。本發(fā)明充分分析了牛流行 熱病毒基因序列，篩選出相對保守的基因片段，在保守的基因片段中設(shè)計(jì)了很多組引物對， 最后經(jīng)過逐一篩選發(fā)現(xiàn)，即使是在保守序列中設(shè)計(jì)的引物也不一定能夠?qū)Ｒ恍缘臋z測牛流 行熱病毒。最后，經(jīng)過大量的引物篩選工作，發(fā)明人終于找到一組可專一性檢測牛流行熱病 毒的LAMP引物。
[0008] 如上所述檢測牛流行熱病毒的LAMP引物在制備牛流行熱病毒檢測試劑盒方面的 應(yīng)用。
[0009] 一種檢測牛流行熱病毒的LAMP試劑盒，包含一組LAMP引物，該引物由外引物對F3/B3和內(nèi)引物對FIP/BIP組成，引物的序列如SEQIDN0:l~4所示。
[0010] 優(yōu)選地，檢測牛流行熱病毒的LAMP試劑盒的反應(yīng)體系如下： BstDNAPolymerase1.0uL； lOXBuffer 2. 5uL； 病毒質(zhì)粒 l.OyL; dNTPsMix(lOmM) 3. 0yL； MgS04 (lOOmM) 1. 0yL； 甜菜喊（5M) 5. 0yL； FIP/BIP 1. 6yM； F3/B3 0. 2yM； DEPC水 定容至25yL。
[0011]優(yōu)選地，檢測牛流行熱病毒的LAMP試劑盒的LAMP反應(yīng)條件為64°C，反應(yīng)60min， 86°〇滅活31^11，41：保存。
[0012] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果： 本發(fā)明充分分析了牛流行熱病毒基因序列，篩選出相對保守的基因片段，在保守的基 因片段中設(shè)計(jì)了很多組引物對，最后經(jīng)過逐一篩選發(fā)現(xiàn)，即使是在保守序列中設(shè)計(jì)的引物 也不一定能夠?qū)Ｒ恍缘臋z測牛流行熱病毒。最后，經(jīng)過大量的引物篩選工作，發(fā)明人終于找 到一組可專一性檢測牛流行熱病毒的LAMP引物。并以該引物建立了檢測牛流行熱病毒的 LAMP方法，該方法靈敏性、特異性和穩(wěn)定度都很好。
【附圖說明】
[0013] 圖 1 為溫度對LAMP反應(yīng)的影響；M:DL2000Marker;1 :60°C;2 :61°C;3 :62°C;4 : 63°C;5 :64°C;6 :65°C。
[0014] 圖2為內(nèi)外引物比例對LAMP反應(yīng)的影響；M:DL2000Marker;1 :0. 2yM(外)， 0. 2yM(內(nèi)）；2:0.2yM(外），0.4yM(內(nèi)）；3:0.2yM(外），0.8yM(內(nèi)）；4:0.2yM(外），l.OyM(內(nèi)）；5:0.2yM(外），1.2yM(內(nèi)）；6:0.2yM(外），1.6yM(內(nèi)）；7:0.2yM(外）， 1.8yM(內(nèi)）；8:0.2yM(外)，2.0yM(內(nèi)）；N:陰性對照。
[0015] 圖 3 為Mg2+濃度對LAMP反應(yīng)的影響，M:DL2000Marker;1:lmM;2 :2mM;3 :3mM;4 : 4mM;5 :5mM;6 :7mM;N:陰性對照。
[0016] 圖 4 為dNTPsMix濃度對LAMP反應(yīng)的影響；M:DL2000Marker; 1 :0? 8yM;2 : 1. 2yM;3 :1. 6yM;4 :2. 0yM;5 :2. 4yM;6 :2. 8yM;7 :3. 2yM;N:陰性對照。
[0017] 圖 5 為為甜菜堿濃度對LAMP反應(yīng)的影響；M:DL2000Marker;1 :0. 4M;2 :0. 6M;3 : 0? 8M;4 :1. 0M;5 :1. 2M;6 :1. 4M;N:陰性對照。
[0018] 圖 6 為為反應(yīng)時(shí)間對LAMP反應(yīng)的影響；M:DL2000Marker;1 :10min;2 :20min;3 : 30min;4 :40min;5 :50min;6 :60min〇
[0019] 圖7為牛流行熱陽性質(zhì)粒LAMP擴(kuò)增結(jié)果；M:DL2000Marker;1 :牛流行熱陽性質(zhì) 粒LAMP擴(kuò)增條帶。
[0020] 圖 8 為普通PCR擴(kuò)增敏感性結(jié)果；M:DL2000Marker;1 :8. 5XlOSg/yL; 2 ：8. 5X10°ng/yL；3 ：8. 5X10_1ng/yL；4 ：8. 5X10_2ng/yL；5:8. 5X10_3ng/yL；6 ： 8. 5Xl(T4ng/yL〇
[0021] 圖 9 為LAMP擴(kuò)增敏感性結(jié)果；M:DL2000Marker;1 :8. 5XlObg/yL;2 : 8. 5X10°ng/yL；3 ：8. 5X10_1ng/yL；4 ：8. 5X10_2ng/yL；5 ：8. 5X10_3ng/yL；6 ： 8. 5Xl(T4ng/yL〇
[0022] 圖 10 為BEFVLAMP反應(yīng)特異性；M:DL2000Marker;1:BEFV;2:AKV(赤羽病病 毒）；3:IBRV(牛傳染性鼻氣管炎病毒）；4:BVDV(牛病毒性腹瀉病毒）N:陰性對照。
[0023] 圖11為LAMP穩(wěn)定性；M:DL2000Marker;1 :牛流行熱陽性樣品擴(kuò)增條帶；N:陰性 對照。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 下面結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明作出進(jìn)一步地詳細(xì)闡述，所述實(shí)施例 只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中所使用的試驗(yàn)方法如無特 殊說明，均為常規(guī)方法；所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，為可從商業(yè)途徑得到的試劑 和材料。
[0025] 牛赤羽病病毒、牛病毒性腹瀉病毒和牛傳染性鼻氣管炎病毒核酸由廣東省檢驗(yàn)檢 疫技術(shù)中心動(dòng)物檢驗(yàn)室惠贈(zèng)。
[0026] 實(shí)施例1 一、LAMP引物的設(shè)計(jì)：本發(fā)明充分分析了牛流行熱病毒基因序列（GenBank中已發(fā)表)， 篩選出相對保守的基因片段，在保守的基因片段中設(shè)計(jì)了很多組引物對，最后經(jīng)過逐一篩 選發(fā)現(xiàn)，即使是在保守序列中設(shè)計(jì)的引物也不一定能夠?qū)Ｒ恍缘臋z測牛流行熱病毒。最后， 經(jīng)過大量的引物篩選工作，發(fā)明人終于找到一組可專一性檢測牛流行熱病毒的LAMP引物。 由外引物對F3/B3和內(nèi)引物對FIP/BIP組成，引物序列見表1。
[0027] 表1.檢測牛流行熱病毒的LAMP引物序列
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種檢測牛流行熱病毒的LAMP引物，其特征在于，由外引物對F3/B3和內(nèi)引物對 FIP/BIP組成，引物的序列如SEQ ID N0:l~4所示。
2. 權(quán)利要求1所述檢測牛流行熱病毒的LAMP引物在制備牛流行熱病毒檢測試劑盒中 的應(yīng)用。
3. -種檢測牛流行熱病毒的LAMP試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求1所述的LAMP引 物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的反應(yīng)體系如下： Bst DNA Polymerase I.0 μ L ； IOXBuffer 2. 5 μ L ； 病毒質(zhì)粒 LOyL; dNTPs Mix (IOmM) 3. 0 μ L ； MgSO4 (IOOmM) LOyL; 甜菜喊（5Μ) 5. 0 μ L ； FIP/BIP I. 6 μΜ ； F3/B3 0. 2 μΜ ； DEPC水 定容至25 μ L。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的LAMP反應(yīng)條件為64°C，反 應(yīng) 60min，86°C 滅活 3min，4°C 保存。
【專利摘要】本發(fā)明屬于病原微生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體公開了一種檢測牛流行熱病毒的LAMP方法。本發(fā)明充分分析了牛流行熱病毒基因序列，篩選出相對保守的基因片段，在保守的基因片段中設(shè)計(jì)了很多組引物對，最后經(jīng)過逐一篩選發(fā)現(xiàn)，即使是在保守序列中設(shè)計(jì)的引物也不一定能夠?qū)Ｒ恍缘臋z測牛流行熱病毒。最后，經(jīng)過大量的引物篩選工作，發(fā)明人終于找到一組可專一性檢測牛流行熱病毒的LAMP引物。并以該引物建立了檢測牛流行熱病毒的LAMP方法，該方法靈敏性、特異性和穩(wěn)定度都很好。
【IPC分類】C12N15-11, C12Q1-70, C12Q1-68
【公開號】CN104830999
【申請?zhí)枴緾N201510273814
【發(fā)明人】李守軍, 韓太光, 賈坤, 遠(yuǎn)立國, 孫凌霜
【申請人】華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年8月12日
【申請日】2015年5月26日