糖苷酶抑制劑及其用圖
【專利說明】糖苷酶抑制劑及其用途 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及抑制糖苷酶的化合物及其用途。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 許多不同的細胞蛋白（細胞核和細胞質(zhì)兩者）是通過添加經(jīng)由0-糖苷鍵連接的 單糖2-乙酰氨基-2-脫氧-e -D-吡喃葡萄糖苷（e -N-乙酰葡糖胺）而進行翻譯后修飾 、此修飾通常被稱為〇-連接的N-乙酰葡糖胺或0-GlcNAc。負責使0 -N-乙酰葡糖胺 (GlcNAc)翻譯后連接至許多核質(zhì)蛋白的特異性絲氨酸和蘇氨酸殘基的酶為O-GIcNAc轉(zhuǎn)移 酶（OGT)2A被稱為糖蛋白2-乙酰氨基-2-脫氧-0 -D-吡喃葡萄糖苷酶（0-GlcNAcase)6' 7的第二酶除去該翻譯后修飾以釋放出蛋白，使得0-GlcNAc-修飾成為在蛋白壽命期間多次 發(fā)生的動態(tài)循環(huán) 8。
[0004]O-GlcNAc-修飾的蛋白調(diào)節(jié)許多重要的細胞功能，包括例如轉(zhuǎn)錄9_12、蛋白酶體降 解13和細胞信號轉(zhuǎn)導14。在許多結(jié)構(gòu)蛋白上也發(fā)現(xiàn)了 O-GlcNAc1547。例如，其已在許多細胞 骨架蛋白上被發(fā)現(xiàn)，包括神經(jīng)絲蛋白18' 19、突觸蛋白6'2°、突觸蛋白-特異性網(wǎng)格蛋白裝配蛋 白AP-3 7和錨定蛋白G 14。已在腦中發(fā)現(xiàn)豐富的O-GIcNAc修飾21'22。其還已經(jīng)在明確涉及 幾種疾?。òò柎暮Ｄ。ˋD)和癌癥）的病因?qū)W的蛋白上被發(fā)現(xiàn)。
[0005] 例如，完全確定的是，AD和許多相關(guān)tau蛋白病，包括唐氏綜合征、皮克氏癥、尼 曼-皮克氏C型癥和肌萎縮性側(cè)索硬化癥（ALS)，部分地以神經(jīng)原纖維纏結(jié)（NFT)的發(fā)展為 特征。這些NFT為成對螺旋絲樣結(jié)構(gòu)（PHF)的聚集體，且由異常形式的細胞骨架蛋白"tau" 組成。tau通常穩(wěn)定微管的關(guān)鍵細胞網(wǎng)絡(luò)，其為神經(jīng)元內(nèi)分配蛋白和營養(yǎng)素所必需的。然 而，在AD患者中，tau變得過度磷酸化，擾亂其正常功能，形成PHF且最終聚集形成NFT。在 人腦中發(fā)現(xiàn)了 tau的6種同種型。在AD患者中，tau的所有6種同種型皆在NFT中被發(fā)現(xiàn)， 且所有6種皆顯著地過度磷酸化23' 24。在健康的腦組織中的tau僅攜帶2或3個磷酸酯基 團，而在AD患者腦中發(fā)現(xiàn)的tau平均攜帶8個磷酸酯基團 25'26。在AD患者腦中的NFT水 平與癡呆癥的嚴重性之間明確的平行性強力地支撐tau功能障礙在AD中的關(guān)鍵作用 27_29。 tau的這種過度磷酸化的確切原因仍然難以捉摸。因此，相當大的努力曾經(jīng)致力于：a)闡明 tau過度磷酸化的分子生理基礎(chǔ) 3°;及b)鑒別能限制tau過度磷酸化的策略，希望這些策略 可以停止或甚至逆轉(zhuǎn)阿爾茨海默病的進展^34。到目前為止，雖然最近已提出這種過度磷酸 化的替代基礎(chǔ) 21，一些證據(jù)跡象表明，許多激酶的上調(diào)可能涉及tau的過度磷酸化21'35' 36。
[0006] 具體地，已經(jīng)出現(xiàn)了通過tau上的O-GlcNAc水平來調(diào)節(jié)tau的磷酸酯水平。在tau 上存在的O-GIcNAc已經(jīng)激勵了將O-GIcNAc水平與tau磷酸化水平相關(guān)聯(lián)的研宄。在該領(lǐng) 域的興趣起源于以下的觀察：已經(jīng)發(fā)現(xiàn)O-GIcNAc修飾出現(xiàn)于許多蛋白上已知經(jīng)歷磷酸化 的氨基酸殘基處37^39。與此觀察一致的是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)磷酸化水平的提高導致降低的O-GlcNAc 水平，而相反地，提高的O-GIcNAc水平與降低的磷酸化水平相關(guān)聯(lián)4°。O-GIcNAc與磷酸化 之間的這種彼此相反的關(guān)系已被稱為"陰-陽（Yin-Yang)假設(shè)"41，且已經(jīng)通過酶OGT 4與 用于從蛋白除去磷酸酯基團的磷酸酶一起形成功能性復合物的發(fā)現(xiàn)而得到強力的生化支 持42。像磷酸化一樣，O-GIcNAc為能夠在蛋白壽命期間被除去和重建數(shù)次的動態(tài)修飾。提 示性地，已將編碼O-GlcNAcase的基因標定成與AD連接的染色體位點7' 43。在人AD腦中過 度磷酸化的tau具有明顯比健康人腦中所發(fā)現(xiàn)的更低的O-GIcNAc水平21。已經(jīng)表明，來自 患有AD的人腦的可溶性tau蛋白的O-GlcNAc水平，明顯低于那些來自健康腦部的可溶性 tau蛋白的O-GlcNAc水平 21。還表明，來自患病腦部的PHF完全毫無任何O-GlcNAc修飾 21。tau的這種低糖基化的分子基礎(chǔ)是未知的，雖然其可能起源于增加的激酶活性和/或參 與加工O-GIcNAc的酶之一的功能障礙。在小鼠的PC-12神經(jīng)細胞和腦組織切片兩者中支 持該后一觀點，使用了非選擇性N-乙酰葡萄糖胺酶抑制劑來提高tau O-GIcNAc水平，此時 觀察到磷酸化水平降低21。這些共同的結(jié)果暗示，通過維持AD患者中的健康O-GIcNAc水平 (諸如通過抑制O-GlcNAcase的作用），應(yīng)該能阻斷tau的過度磷酸化和tau過度磷酸化的 所有相關(guān)效應(yīng)，包括形成NFT和下游效應(yīng)。然而，因為0-氨基己糖苷酶恰當發(fā)揮功能至關(guān) 重要，所以用于AD治療的阻斷O-GlcNAcase作用的任何潛在治療介入，必須避免伴隨抑制 氨基己糖苷酶A和B。
[0007] 神經(jīng)元不儲存葡萄糖，因此腦部依賴由血液供給的葡萄糖來維持其基本的代謝功 能。尤其地，已經(jīng)表明腦內(nèi)的葡萄糖攝取及代謝隨著變老而降低 44。在AD患者的腦內(nèi)發(fā)生 顯著降低的葡萄糖利用性，且被認為是神經(jīng)變性的潛在原因45。這種AD腦中的降低的葡萄 糖供給的基礎(chǔ) 46_48被認為起源于降低的葡萄糖輸送49'5°、受損的胰島素信號轉(zhuǎn)導 51'52和降低 的血流量53中任何一個。
[0008] 鑒于這種受損的葡萄糖代謝，值得注意的是進入細胞中的所有葡萄糖中2-5%被 分流至己糖胺生物合成途徑中，從而調(diào)節(jié)該途徑的最終產(chǎn)物（尿苷二磷酸-N-乙酰葡萄 糖胺（UDP-GlcNAc))的細胞濃度 54。UDP-GlcNAc為核質(zhì)酶O-GIcNAc轉(zhuǎn)移酶（OGT)的底 物2_5,其用于翻譯后添加GIcNAc至許多核質(zhì)蛋白的特異性絲氨酸和蘇氨酸殘基中。OGT 通過其三角形四肽重復（TPR)結(jié)構(gòu)域 58'59識別許多其底物55'56及結(jié)合伴侶42' 57。如上所 述，0-GlcNAcase6'7除去該翻譯后修飾以釋放出蛋白，使得O-GlcNAc-修飾成為在蛋白壽 命期間多次發(fā)生的動態(tài)循環(huán) 8。已經(jīng)在若干蛋白中已知的磷酸化位點上發(fā)現(xiàn)了 0-GlcNAc10' 38'39'6°，包括tau和神經(jīng)纖維絲 61。另外，OGT表現(xiàn)出不尋常的動力學行為，使其對細胞內(nèi) UDP-GlcNAc底物濃度極其敏感，并因此對葡萄糖供給極其敏感 42。
[0009] 與己糖胺生物合成途徑的已知特性、OGT的酶特性及O-GIcNAc與磷酸化之間彼此 相反的關(guān)系一致的是，已經(jīng)證明腦中降低的葡萄糖利用率造成tau過度磷酸化 45。因此，逐 漸受損的葡萄糖輸送和代謝（不管其原因如何）造成O-GIcNAc降低和tau(及其它蛋白） 的過度磷酸化。因此，抑制O-GlcNAcase應(yīng)當補償在健康對象以及患有AD或相關(guān)神經(jīng)變性 疾病患者的腦內(nèi)與年齡相關(guān)的葡萄糖代謝受損。
[0010] 這些結(jié)果表明，調(diào)節(jié)tau O-GlcNAc水平的機制功能失常在形成NFT和相關(guān)神經(jīng)變 性中可能非常重要。阻斷tau過度磷酸化作為治療上有用的介入的良好支持 62來自最近的 研宄，所述研宄表明當攜帶人類tau的轉(zhuǎn)基因小鼠被激酶抑制劑處理時，它們并未發(fā)展成 典型的運動缺陷 34,而在另一實例中33,表明不可溶性tau的水平降低。這些研宄提供了在 這種疾病的小鼠模型中，降低tau磷酸化水平與減輕AD樣行為癥狀之間清晰的關(guān)聯(lián)。事實 上，對tau過度磷酸化進行藥理調(diào)節(jié)被廣泛認定為治療AD和其它神經(jīng)變性病癥的有效治療 策略 63。
[0011] 限制tau過度磷酸化的小分子O-GlcNAcase抑制劑已被考慮用于治療AD和有關(guān) tau蛋白病64。具體地，所述O-GlcNAcase抑制劑thiamet-G已經(jīng)涉及在培養(yǎng)的PC-12細 胞中的病理相關(guān)位點上降低tau磷酸化64。此外，向健康Sprague-Dawley大鼠口服施用 thiamet-G已經(jīng)涉及在大鼠皮質(zhì)和海馬體兩者中Thr231、Ser396和Ser422上降低tau磷 酸化64。
[0012] 還有大量的證據(jù)表明，O-GlcNAc蛋白修飾的水平提高提供了對心臟組織中應(yīng)激反 應(yīng)的致病效應(yīng)的保護，所述應(yīng)激包括由局部缺血、出血、低血容量性休克和鈣反常所引起的 應(yīng)激。例如，通過施用葡糖胺來活化己糖胺生物合成途徑（HBP)，已證明在局部缺血/再灌 注65'創(chuàng)傷性出血 72'低血容量性休克75和鈣反常65'76的動物模型中發(fā)揮保護效應(yīng)。此 外，強有力的證據(jù)表明，升高水平的蛋白O-GIcNAc修飾介導這些心臟保護效應(yīng)65'66'68' 71'73' 76,〇還存在的證據(jù)是，O-GIcNAc修飾在包括帕金森氏癥和亨廷頓氏癥在內(nèi)的各種神經(jīng)變 性疾病中發(fā)揮作用8°。
[0013] 人類有三種編碼裂解糖綴合物的末端e-N-乙酰葡糖胺殘基的酶的基因。這些 基因中的第一種基因編碼O-GlcNAcase。O-GlcNAcase為糖苷水解酶的家族84中的成員， 所述家族包括來自從原核生物病原至人的各種有機體的酶（對于糖苷水解酶的家族分類， 參見 Coutinho, P. M. &Henrissat，B. (1999) Carbohydrate-Active Enzymes server 在 URL : http://afmb. cnrs-mrs. fr/CAZY/ 上 81'82)。O-GlcNAcase 用于水解以除去翻譯后修飾的蛋 白上絲氨酸和蘇氨酸殘基的0-GlcNAc1'6' 7'83'84。與O-GlcNAc存在于許多細胞內(nèi)蛋白上一致 的是，該O-GlcNAcase酶看來在幾種疾病的病因?qū)W中發(fā)揮作用，包括II型糖尿病 14'85、AD16' 21'86和癌癥 22'87。雖然有可能在更早之前分離