通過等位基因替代生成fmdv抗性牲畜的制作方法
【專利說明】
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本專利申請要求2013年3月15日提交的美國專利申請?zhí)朜o. 13/836,860,以及 2012年7月31日提交的美國臨時申請?zhí)朥S61/677904的優(yōu)先權(quán)，兩者通過引用并入本文。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003]
技術(shù)領(lǐng)域涉及遺傳修飾的動物及相關(guān)技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0004] 感染口蹄疫病毒（FMDV)的偶蹄類動物由于急性水皰病變得迅速喪失行為能力。 牛和豬的FMD感染引起發(fā)熱，痛性起泡，跛行以及食欲喪失。如感染原的名字所暗示的，經(jīng) 常會發(fā)生足部的二次感染，引起慢性跛行以及延遲愈合，類似地乳腺炎在奶牛中可為常見 的結(jié)局。該疾病的急性階段持續(xù)大約一周后在面對上升的免疫應(yīng)答時消退，其中的抗體反 應(yīng)顯得尤其重要，因為它從血流中高效地清除病毒。由于導(dǎo)致循環(huán)衰竭的心肌感染，死亡 可發(fā)生在年輕動物中。該疾病為如此的高度傳染性以至于在單個動物中的感染需要對整個 牲畜群進(jìn)行毀滅和掩埋。因此FMDV被認(rèn)為是世界上馴養(yǎng)的農(nóng)場動物（domesticatedfarm animals)的最重要病原體。2001年在英國FMD的爆發(fā)造成了約$40-120億的總損失[1]， 以及十多年前美國加州大學(xué)戴維斯分校估計僅在加利福尼亞州的FMD爆發(fā)由于動物流動 和售賣上的限制，在控制花費和市場丟失上可能花費了 $60-140億。牛奶、和其他產(chǎn)品以及 肉類的售賣被停止，并且在相關(guān)行業(yè)中生產(chǎn)者和工人們的職位會丟失或被嚴(yán)重縮減。其他 國家的經(jīng)濟(jì)影響是成比例的。
[0005] 發(fā)明概述
[0006] 本文中記載了抗FMDV的動物。該動物可通過僅最小核苷酸改變且在精確位置進(jìn) 行改變而不對動物基因組進(jìn)行其他改變而產(chǎn)生。
[0007] 本發(fā)明的一個實施方式是遺傳修飾的動物，其包括對eIF4G基因的基因組修飾。 該修飾可以包括例如eIF4G基因的一個或多個堿基的插入、缺失，或者取代。eIF4G基因可 以改變?yōu)楸磉_(dá)出相對于動物野生型eIF4G蛋白改變的eIF4G蛋白以對口蹄疫病毒酶的蛋白 酶的切割有抗性，所述蛋白酶例如下列一個或兩個：口蹄疫病毒酶的前導(dǎo)蛋白酶（Lpro)以 及口蹄疫病毒酶的病毒編碼3C蛋白酶（3Cpro)。動物可以是哺乳動物。動物可以是實驗 室研宄動物（例如，實驗用小鼠、大鼠、狗、或豬物種（例如小型豬））。動物還可以是牲畜 動物，例如，選自由豬、魚、兔、牛、雞、山羊和綿羊構(gòu)成的組。在一些情況下，動物來自第一品 種，遺傳修飾是動物另一個品種中發(fā)現(xiàn)的eIF4G基因的天然等位基因。在另一種情況下，動 物來自第一物種，遺傳修飾是第二物種（人或非人動物）的另一品種中eIF4G基因的等位 基因。一般而言，等位基因不是整個基因，而是編碼介導(dǎo)FMDV蛋白酶結(jié)合以及蛋白水解的 蛋白部分的基因。動物可以是修飾的eIF4G基因上純合性的或雜合性的。動物可以是建立 者動物（founderanimal)或建立者動物的后代，S卩可產(chǎn)生動物的新品種或品系。動物可以 含有由修飾的eIF4G基因表達(dá)的eIF4G蛋白。動物可以對口蹄疫有抗性。經(jīng)修飾的eIF4G 蛋白可經(jīng)修飾以阻止Lpro和Cpro中一個或兩個的結(jié)合。
[0008] 本發(fā)明的一個實施方式是產(chǎn)生遺傳修飾生物體的方法，其包括體外改變原代細(xì)胞 (primarycell)或者胚胎（或在胚胎情況下在子宮中）的天然eIF4G基因，并克隆原代細(xì) 胞或?qū)⑴咛ヒ浦驳侥阁w動物中（代孕者（surrogate))，其中eIF4G基因改變?yōu)楸磉_(dá)抵抗口 蹄疫病毒蛋白酶的蛋白質(zhì)水解的eIF4G同種型（isoform)。該方法可以涉及用位點特異性 核酸酶和核酸模板轉(zhuǎn)染原代細(xì)胞或胚胎，所述位點特異性核酸酶特異性切割天然eIF4G基 因中的位點，所述核酸模板至少包含eIF4G基因的一部分，其中模板提供了天然eIF4G基因 的備選等位基因，所述備選等位基因編碼對口蹄疫病毒酶的蛋白酶切割有抗性的eIF4G同 種型。位點特異性核酸酶的例子是選自由鋅指核酸酶（ZFN)，轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶 (transcriptionalactivator-likeeffectornuclease，TALEN)，以及成族規(guī)律間隔短回 文重復(fù)序列（ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeat) (CRISPR或 有時稱為CRISPR/Cas9)組成的組中的基于核酸酶的系統(tǒng)。
[0009] 一個實施方式是包含對eIF4G基因的基因組修飾的體外細(xì)胞。eIF4G基因可表達(dá) 相對于動物的野生型eIF4G蛋白改變的eIF4G蛋白，從而抵抗口蹄疫病毒酶的蛋白酶的切 害J。細(xì)胞可以選自由小鼠、大鼠、馬、迷你豬（mini-pig)、豬、魚、兔、牛、雞、山羊、偶蹄類、有 蹄類動物、山羊組成的組。細(xì)胞可進(jìn)一步包含修飾的eIF4G基因表達(dá)的eIF4G蛋白。
[0010] 本發(fā)明的實施方式包括分離的核酸，其編碼任何eIF4G蛋白的同種型，例如對口 蹄疫病毒酶的蛋白酶裂解有抗性的eIF4G蛋白。
[0011] 本發(fā)明的實施方式包括細(xì)胞、生物體、或者動物，其包含表達(dá)eIF4G蛋白或被FMDV 蛋白酶結(jié)合的所述蛋白的一部分的外源基因。外源基因表達(dá)競爭FMDV病毒結(jié)合從而降低 天然蛋白的切割。另外，eIF4G蛋白酶抗性的外源基因的表達(dá)為感染細(xì)胞提供了持續(xù)的細(xì) 胞功能。一個實施方式是產(chǎn)生遺傳修飾的生物體的方法，包括體外將外源eIF4G基因的表 達(dá)添加到原代細(xì)胞或者胚胎中，克隆原代細(xì)胞或?qū)⑴咛ヒ浦驳侥阁w動物中，外源eIF4G基 因表達(dá)eIF4G同種型，其抵抗由口蹄疫蛋白酶進(jìn)行的蛋白質(zhì)水解。一個實施方式是包含對 eIF4G基因的基因組修飾或表達(dá)外源eIF4G基因的核酸的體外細(xì)胞。
[0012] 附圖簡述
[0013] 圖1是體內(nèi)總細(xì)胞蛋白的電泳圖譜的放射自顯影；來自細(xì)胞的35S標(biāo)記總蛋白在 底部成像為以時間計的小核糖核酸病毒（Picornaviral)感染后時間的函數(shù)；全細(xì)胞裂解 (6. 5小時后）顯示出宿主蛋白關(guān)閉的時間進(jìn)程以及小核糖核酸病毒（picornaviral)蛋白 的多肽合成的近完全接管（takeover)。在5小時時的顯著條帶是由來自多蛋白前體的Lpro 切割的病毒蛋白（凝膠頂端的深色條帶）。在近凝膠底部的強(qiáng)條帶是源自于非多聚腺苷酸 化1111?敵(11011-口〇15^(1611713七6(11111?敵）的組蛋白，因此不是6正46依賴的并對病毒蛋白酶活 性敏感。
[0014] 圖2顯示了改變EIF4GI基因的一部分的實驗結(jié)果。豬EIF4GI的一部分的序列 顯示于小圖A。野生型序列在相對于Lpro切割位點（箭頭）的-3和-2位具有天冬酰 胺和亮氨酸殘基。在該實施例中，提供模板以指導(dǎo)用天冬氨酸和苯丙氨酸來取代-3位 和-2位殘基，從而使修飾的EIF4GI對Lpro切割有抗性。兩對TALENs(頂部）設(shè)計為剪 切野生型EIF4GI以刺激同源重組。小圖B)描述了用各個TALEN對轉(zhuǎn)染豬成纖維細(xì)胞的 Surveyor(Cel-I)測定法的結(jié)果。小圖C)描述了確定同源重組效率的RFLP檢測。該圖包 括左TALENCCGTCCTTTGCCAACCTT(SEQIDN0:12)，右TALENAGCAACCGTGGGCCCCCA(SEQID N0:13)，&TALENTGGCCGACCAGCCCTT(SEQIDN0:14);STALENCCCAAGGGGTGGGCC(SEQID NO: 15) ;EIF4GI基因部分CAGACTTCACTCCGTCCTTTGCCAACCTTGGCCGACCAGCCCTTAGCAACCGTGG GCCCCCAAGGGGTGGGCC(SEQIDN0:16);以及HDRCAGACTTCACTCCGTCCTTTGCCGACTTCGGCCGAC CAGCCCTTAGCAACCGTGGGCCCCCAAGGGGTGGGCC(SEQIDN0:17)。
[0015] 詳細(xì)描述
[0016] 本公開解釋了如何制備抗FMDV的動物。動物被遺傳修飾，使得它們的真核翻譯起 始因子4G蛋白（eIF4G)抵抗FMDV蛋白酶Lpro和3Cpro中一個或兩個的切割（在此統(tǒng)稱 為FMDV蛋白酶）。它們是由FMDV生產(chǎn)的蛋白酶，其可以攻擊eIF4G蛋白。運作的實施例包 括產(chǎn)生經(jīng)修飾的抗FMDV蛋白酶中一種攻擊的牲畜原代細(xì)胞。采用經(jīng)發(fā)明人證明過的對建 立者動物（founderanimals)有效的技術(shù)，動物可以克隆自這些細(xì)胞。這種修飾可以以位 點特異性方式制造，從而天然基因的等位基因經(jīng)過修飾以制備表達(dá)抗FMDV蛋白酶的eIF4G 蛋白的修飾等位基因。
[0017] FMDV抗性
[0018] FMDV屬于小核糖核酸病毒家族的口蹄病毒（Aphthovirus)屬，為包括脊髓灰質(zhì)炎 病毒（poliovirus)、鼻病毒（rhinovirus)(普通感冒）、以及甲型肝炎的動物病毒中最小 的。存在著具有多個亞型的七種血清型[2]。與其他小核糖核酸病毒相似，F(xiàn)MDV基因組是 可以直接翻譯（正鏈基因組）的約8500個核苷酸的單鏈RNA，其編碼超過IOOkDa的單一多 蛋白。FMDVRNA的N-端區(qū)域編碼木瓜蛋白酶樣蛋白酶，稱為Lp"°，其有兩個同種型，Lab和 Lb，其中Lb是重要的產(chǎn)品[3]。Lpm不僅格外小而且還是格外特異性的。當(dāng)Lpm序列被合成 后其首先切割FMDV多蛋白，使自身從多蛋白中釋放出來。接著游離的Lpm進(jìn)一步將剩余的 多蛋白剪切成單個的功能性多肽，單個的功能性多肽產(chǎn)生大量的子代病毒。Lpra具有幾個其 他的靶位點，其中最重要的似乎為真核翻譯起始因子4G(eIF4G)[4,5]，其當(dāng)由Lpm進(jìn)行的 切割時不能促發(fā)哺乳動物細(xì)胞的4mG-帽化的mRNA的啟動。EIF4G(其有eIF4GI和eIF4GII 兩種同種型）是一種集合在所有帽化且多聚腺苷酸化的mRNA的5'和3'端附著于結(jié)構(gòu)的 幾個eIF4RNA結(jié)合蛋白的支架蛋白。在一些小核糖核酸病毒中，如脊髓灰質(zhì)炎病毒中，2APM 蛋白酶與Lpro具有等同的活性。
[0019] eIF4G的凈效應(yīng)是非共價鍵橋接末端真核mRNA