具有葉綠素酶活性的多肽和對其進(jìn)行編碼的多核苷酸的制作方法
【專利說明】具有葉綠素酶活性的多肽和對其進(jìn)行編碼的多核苷酸
[0001] 對序列表的引用
[0002] 本申請包括一個(gè)計(jì)算機(jī)可讀形式的序列表，將其通過引用結(jié)合在此。
[0003] 發(fā)明背景 發(fā)明領(lǐng)域
[0004] 本發(fā)明涉及具有葉綠素酶活性的多肽和編碼這些多肽的多核苷酸的用途。本發(fā)明 還涉及包括這些多核苷酸的核酸構(gòu)建體、載體、以及宿主細(xì)胞連同產(chǎn)生這些多肽的方法。本 發(fā)明具體涉及具有葉綠素酶活性的多肽在食品應(yīng)用和洗滌劑中的用途。
[0005] 相關(guān)技術(shù)說明
[0006] 眾所周知植物中葉綠素酶具有酶活性，并且多種植物葉綠素酶描述于US 2005/0081263(杜邦公司（DuPont))中。葉綠素酶具有酯酶活性，通過切割酯鍵釋放葉 綠素中的植醇側(cè)鏈，以形成脫植基葉綠素和游離的植醇。葉綠素是植物中發(fā)現(xiàn)的一種綠色 色素并且因此源自植物的許多產(chǎn)物包含葉綠素。在許多植物來源的食物產(chǎn)品，例如植物油 中，通常不希望葉綠素的存在，因?yàn)槠涑耸褂椭?，還可引起氧化，導(dǎo)致油變質(zhì)。植 物葉綠素酶已經(jīng)用于，例如，降解植物油中的葉綠素。通過添加葉綠素酶升級植物油已經(jīng) 顯示有效于減少植物油中的葉綠素，如在WO2011/110967(丹尼斯克公司（DaniscoA/S)) 中描述的。含葉綠素的食物、飼料或植物油的酶加工描述于WO2006/009676(戴維斯公司 (DiversaCorporation))中。
[0007] 洗滌劑通常包括多種活性成分，例如酶、表面活性劑、助洗劑、以及漂白系統(tǒng)的一 個(gè)復(fù)雜組合。盡管當(dāng)前洗滌劑具有復(fù)雜度，許多污物難以完全去除。特別頑固的污物群是 包含葉綠素的污物，例如，草漬。草漬可以是蛋白質(zhì)、多種有機(jī)物質(zhì)、葉綠素以及其他相對穩(wěn) 定的著色化合物（例如，葉黃素和類萌蘿卜素）的一種混合物。葉綠素酶已經(jīng)被用于洗滌 劑中，例如，在WO2009/141073(科萊恩公司（ClariantInt.Ltd./C-LECTA))中描述了包 含葉綠素酶的一種清潔劑。葉綠素酶優(yōu)選地與脂肪酶，特別是半乳糖脂酶組合使用。
[0008] 最常用的葉綠素酶源于植物，使植物以工業(yè)相關(guān)量表達(dá)是具有挑戰(zhàn)性的。本發(fā)明 提供了源自Nakamurellamultipartita的一種葉綠素酶，該葉綠素酶與植物葉綠素酶具有 極低同源性。該葉綠素酶用于食品和洗滌劑應(yīng)用。
[0009] 發(fā)明概述
[0010] 本發(fā)明涉及具有葉綠素酶活性的多肽在食品（例如用于處理植物油）和洗滌劑中 的用途。
[0011] 葉綠素酶已經(jīng)在洗滌劑組合物以及食物產(chǎn)品（例如，植物油）加工中使用。本發(fā) 明的葉綠素酶對于這些目的也是有用的。
[0012] 本發(fā)明的第一方面涉及一種組合物，該組合物包括一種多肽，該多肽與SEQID N0:2具有至少60%-致性，其中該多肽具有葉綠素酶活性。另一個(gè)方面涉及一種多肽的用 途，該多肽與SEQIDN0:2具有至少60%-致性，其中該多肽在清潔過程中具有葉綠素酶活 性。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及一種進(jìn)行清潔的方法，該方法包括使一種織物或紡織品與一 種洗滌劑組合物或添加劑接觸，該滌劑組合物或添加劑包括與SEQIDNO: 2具有至少60% 一致性的一種葉綠素酶。
[0013] 本發(fā)明的一個(gè)具體方面涉及一種清潔組合物，該清潔組合物包括具有葉綠素酶活 性的一種分離的多肽，該分離的多肽選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：
[0014] (a) -種多肽，該多肽與SEQIDNO:2的多肽具有至少60%序列一致性；
[0015] (b) -種多肽，該多肽由在中嚴(yán)謹(jǐn)度條件、或中-高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下與以下各項(xiàng)雜交 的多核苷酸編碼
[0016] (i)SEQIDNO: 1的成熟多肽編碼序列，和/或
[0017] (ii)⑴的全長互補(bǔ)鏈；
[0018] (c) -種多肽，該多肽由與SEQIDNO: 1的成熟多肽編碼序列具有至少60%序列 一致性的多核苷酸編碼；
[0019] (d)SEQIDNO: 2的多肽的一種變體，該變體在一個(gè)或多個(gè)（例如若干個(gè)）位置處 包含取代、缺失、和/或插入；以及
[0020] (e) (a)、（b)、（c)、或（d)的多肽的一個(gè)片段，該片段具有葉綠素酶活性。
[0021] 本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及具有葉綠素酶活性的一種分離的多肽在一種清潔過程 中的用途，該分離的多肽選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：
[0022] (a) -種多肽，該多肽與SEQIDNO:2的多肽具有至少60%序列一致性；
[0023] (b) -種多肽，該多肽由在中嚴(yán)謹(jǐn)度條件、或中-高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下與以下各項(xiàng)雜交 的多核苷酸編碼
[0024] ⑴SEQIDNO: 1的成熟多肽編碼序列，和/或
[0025] (ii)⑴的全長互補(bǔ)鏈；
[0026] (c) 一種多肽，該多肽由與SEQIDNO: 1的成熟多肽編碼序列具有至少60%序列 一致性的多核苷酸編碼；
[0027] (d)SEQIDNO: 2的多肽的一種變體，該變體在一個(gè)或多個(gè)（例如若干個(gè)）位置處 包含取代、缺失、和/或插入；以及
[0028] (e) (a)、（b)、（c)、或（d)的多肽的一個(gè)片段，該片段具有葉綠素酶活性。
[0029] 本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一種植物油，該植物油包括具有葉綠素酶活性的一種分離 的多肽，該分離的多肽選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：
[0030] (a) -種多肽，該多肽與SEQIDNO:2的多肽具有至少60%序列一致性；
[0031] (b) -種多肽，該多肽由在中嚴(yán)謹(jǐn)度條件、或中-高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下與以下各項(xiàng)雜交 的多核苷酸編碼
[0032] (i)SEQIDNO: 1的成熟多肽編碼序列，和/或
[0033] (ii)⑴的全長互補(bǔ)鏈；
[0034] (c) 一種多肽，該多肽由與SEQIDNO: 1的成熟多肽編碼序列具有至少60%序列 一致性的多核苷酸編碼；
[0035] (d)SEQIDNO: 2的多肽的一種變體，該變體在一個(gè)或多個(gè)（例如若干個(gè)）位置處 包含取代、缺失、和/或插入；以及
[0036] (e) (a)、（b)、（c)、或（d)的多肽的一個(gè)片段，該片段具有葉綠素酶活性。
[0037] 本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及具有葉綠素酶活性的一種分離的多肽在一種植物油的 加工中的用途，該分離的多肽選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：
[0038] (a) -種多肽，該多肽與SEQIDNO:2的多肽具有至少60%序列一致性；
[0039] (b) -種多肽，該多肽由在中嚴(yán)謹(jǐn)度條件、或中-高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下與以下各項(xiàng)雜交 的多核苷酸編碼
[0040] (i)SEQIDNO: 1的成熟多肽編碼序列，和/或
[0041] (ii)⑴的全長互補(bǔ)鏈；
[0042] (c) 一種多肽，該多肽由與SEQIDNO: 1的成熟多肽編碼序列具有至少60%序列 一致性的多核苷酸編碼；
[0043] (d)SEQIDNO: 2的多肽的一種變體，該變體在一個(gè)或多個(gè)（例如若干個(gè)）位置處 包含取代、缺失、和/或插入；以及
[0044] (e) (a)、（b)、（c)、或（d)的多肽的一個(gè)片段，該片段具有葉綠素酶活性，。
[0045] 本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明的多肽的分離的多核苷酸，包含這些多核苷酸的核酸構(gòu) 建體、重組表達(dá)載體、重組宿主細(xì)胞，并且涉及重組地產(chǎn)生這些多肽的方法。
[0046] 本發(fā)明還涉及用于制備供食物產(chǎn)品（例如植物油）中使用的組合物的方法、用于 處理一種或多種包括本發(fā)明葉綠素酶的植物油的方法。
[0047] 此外，本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明葉綠素酶的洗滌劑組合物，以及使用本發(fā)明的葉 綠素酶進(jìn)行洗衣和或硬表面清潔的方法。
[0048] 本發(fā)明還涉及一種用于處理植物油的方法，該方法包括以下步驟：使該油和與SEQ IDNO2具有至少60%-致性的多肽接觸，其中所述多肽能夠水解葉綠素或葉綠素衍生物， 并且涉及通過根據(jù)本發(fā)明的方法可獲得的粗制或精制的植物油。
[0049] 定義
[0050] 具有葉綠素酶活性的多肽有時(shí)還被指定為果皮葉綠素酶（chlase)或葉綠素脫植 基葉綠素水解酶（chlorophyllchlorophylIidohydrolase) 〇
[0051] 在此將術(shù)語"葉綠素酶"定義為具有葉綠素酶活性或酯酶活性的一種酶，在當(dāng)前背 景下，其被理解為通過切割酯鍵釋放葉綠素中的植醇側(cè)鏈以形成脫植基葉綠素和游離植醇 的一種酶或通過切割酯鍵釋放葉綠素中的植醇側(cè)鏈以形成脫鎂葉綠酸和游離植醇的一種 酯酶。術(shù)語"葉綠素酶"包括屬于EC3. 1.1. 14酶組的任何酶。EC編號參考加利福尼亞州 (California)的圣迭戈（SanDiego)的NC-IUBMB學(xué)術(shù)出版社（AcademicPress)的 1992 年酶命名法，分別包括出版于1994,歐洲生物化學(xué)雜志（Eur.J.Biochem. )223:1-5 ;1995， 歐洲生物化學(xué)雜志232:1-6 ;1996,歐洲生物化學(xué)雜志237:1-5 ;1997,歐洲生物化學(xué)雜志 250:1-6 ;以及1999,歐洲生物化學(xué)雜志264:610-650的增刊1-5。命名會定期得以增補(bǔ)和 更新；參見例如萬維網(wǎng)（WWW)于http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html〇 在本發(fā)明的背景下應(yīng)理解本發(fā)明的葉綠素酶是具有SEQIDNO2的多肽或與其具有至少 60%-致性的一種多肽。由此"具有葉綠素酶活性的多肽"是一種葉綠素酶。
[0052] 本發(fā)明提供了具有葉綠素酶活性的多肽在食物產(chǎn)品（例如植物油）和洗滌劑組合 物（例如洗衣或餐具洗滌組合物）中的用途。本發(fā)明還提供了編碼這些多肽的多核苷酸。 使用在此實(shí)例1中所述來測量葉綠素酶活性。
[0053] 本發(fā)明的葉綠素酶具有SEQIDNO: 2的成熟多肽的至少20%，例如至少40%、至 少50 %、至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %、至少95 %、以及至少100 %的葉綠素酶 活性。
[0054] 如在此使用的術(shù)語"分離的多肽"是指從來源分離的多肽。在一個(gè)方面中，該變 體或多肽是至少20%純的，更優(yōu)選至少40%純的，更優(yōu)選至少60%純的，甚至更優(yōu)選至少 80%純的，最優(yōu)選至少90%純的并且甚至最優(yōu)選至少95%純的，如通過SDS-PAGE所確定。
[0055]術(shù)語"基本上純的多肽"在此指一種包含按重量計(jì)至多10%，優(yōu)選至多8 %，更優(yōu) 選至多6 %，更優(yōu)選至多5 %，更優(yōu)選至多4 %，更優(yōu)選至多3 %，甚至更優(yōu)選至多2 %，最優(yōu)選 至多1 %，并且甚至最優(yōu)選至多0. 5 %的該多肽和與其天然地或重組地相關(guān)的其他多肽材 料的多肽制劑。因此，優(yōu)選的是該基本上純的多肽按存在于該制劑中的所有多肽材料的重 量計(jì)是至少92 %純的，優(yōu)選至少94 %純的，更優(yōu)選至少95 %純的，更優(yōu)選至少96 %純的，更 優(yōu)選至少97%純的，更優(yōu)選至少98%純的，甚至更優(yōu)選至少99%純的，最優(yōu)選至少99. 5% 純的，并且甚至最優(yōu)選100%純的。本發(fā)明的多肽優(yōu)選處于基本上純的形式。其可通過，例 如，以公知的重組方法或以經(jīng)典的純化方法制備該變體或多肽而達(dá)成。
[0056] 術(shù)語"成熟多肽編碼序列"意指編碼具有葉綠素酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在 一個(gè)方面，該成熟多肽是具有SEQIDNO2或SEQIDNO4的多肽。
[0057] 兩個(gè)氨基酸序列之間或兩個(gè)核苷酸序列之間的相關(guān)性由參數(shù)"序列一致性"描 述。出于本發(fā)明的目的，使用尼德曼-翁施（Needleman-Wunsch)算法（尼德曼和翁施， 1970,分子生物學(xué)雜志（J.Mol.Biol. )48:443-453)來確定兩個(gè)氨基酸序列之間的一致性 程度，該算法如EMBOSS軟件包（EMBOSS:歐洲分子生物學(xué)開放軟件套件（TheEuropean MolecularBiologyOpenSoftwareSuite)，賴斯（Rice)等人，2000,遺傳學(xué)趨勢（Trends inGenetics) 16:276-277 :http://emboss,org)(優(yōu)選 3. 0? 0 版或更新版本）的尼德爾 (Needle)程序所實(shí)施的。使用版本6. 1.0。所使用的這些任選參數(shù)是空位開放罰分10、空 位延伸罰分0. 5,及EBL0SUM62 (BL0SUM62的EMBOSS版本）取代矩陣。尼德爾標(biāo)注的"最長 的一致性"的輸出（使用-非簡化選項(xiàng)獲得）被用作百分比一致性，并且如下計(jì)算：
[0058] (一致的殘基X100V(比對長度-比對中的空位總數(shù)）
[0059] 出于本發(fā)明的目的，使用如在EMBOSS包（EMBOSS:歐洲分子生物學(xué)開放軟件套件， 賴斯等人，2000,見上文：http://emboss,orfi)(優(yōu)選3. 0. 0版或更新版本）的尼德爾程序 中所實(shí)施的尼德爾曼-翁施算法（尼德爾曼和翁施，1970,見上文）來確定兩個(gè)脫氧核糖核 苷酸序列之間的一致性程度。使用版本6. 1. 0。所使用的這些任選參數(shù)是空位開放罰分10、 空位延伸罰分0. 5,及EDNAFULL(NCBINUC4. 4的EMBOSS版本）取代矩陣。尼德爾標(biāo)注的 "最長的一致性"的輸出（使用-非簡化選項(xiàng)獲得）被用作百分比一致性，并且如下計(jì)算：
[0060] ( 一致的脫氧核糖核酸核苷酸XlOOV(比對長度-比對中的空位總數(shù)）。
[0061] 術(shù)語"片段"意指使一個(gè)或多個(gè)（若干個(gè)）氨基酸從成熟多肽的氨基和/或羧基 末端缺失的多肽；其中該片段具有葉綠素酶活性。
[0062] 術(shù)語"多肽的功能片段"或"其功能片段"用來描述衍生自更長的多肽（例如，成 熟多肽）的多肽，以及已經(jīng)在N-末端區(qū)或C-末端區(qū)或兩個(gè)區(qū)域中截短以產(chǎn)生親本多肽的 片段的多肽。為了成為功能多肽，該片段必須保持全長/成熟多肽的至少20%，優(yōu)選至少 40 %，更優(yōu)選至少50 %，更優(yōu)選至少60 %，更優(yōu)選至少70 %，更優(yōu)選至少80 %，甚至更優(yōu)選 至少90%，最優(yōu)選至少95%，并且甚至最優(yōu)選至少100 %的葉綠素酶活性。
[0063] 術(shù)語"子序列"意指使一個(gè)或多個(gè)（若干個(gè)）核苷酸從成熟多肽編碼序列的5'端 和/或3'端缺失的多核苷酸，其中該子序列編碼具有葉綠素酶活性的一個(gè)片段。
[0064] 術(shù)語"等位基因變體"意指占用同一染色體位點(diǎn)的一種基因的兩個(gè)或更多個(gè)替代 形式中的任一者。等位基因變異由突變天然產(chǎn)生，并且可以導(dǎo)致群體內(nèi)的多態(tài)性?；蛲?變可以是沉默的（在所編碼的多肽中沒有改變）或可編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。 多肽的等位基因變體是由基因的等位基因變體編碼的多肽。
[0065] 術(shù)語"變體"意指在一個(gè)或多個(gè)（若干個(gè)）位置包含改變（即，一個(gè)或多個(gè)（若干 個(gè)）氨基酸殘基取代、插入和/或缺失）的具有葉綠素酶活性的多肽。取代意指將占據(jù)某 個(gè)位置的氨基酸替換為不同的氨基酸；缺失意指去除占據(jù)某個(gè)位置的氨基酸；并且插入意 指鄰近占據(jù)某個(gè)位置的氨基酸添加1-3個(gè)氨基酸。
[0066] 術(shù)語"清潔組合物"和"清潔配制品"是指用于從有待清潔的物品上除去不希望的 化合物的組合物，這些物品是例如織物、地毯、餐具（包括玻璃器皿）、接觸鏡、硬表面（例如 瓷磚、鋅（zincs)、地板和桌面）、頭發(fā)（香波）、皮膚（肥皂和面霜）、牙齒（漱口劑、牙膏） 等。這些術(shù)語涵蓋針對具體類型的所希望的清潔組合物和產(chǎn)品的形式（例如，液體、凝膠、 顆?；驀婌F組合物）所選的任何材料/化合物，只要該組合物與用于該組合物中的葉綠素 酶以及其他一種或多種酶可相容即可。通過考慮有待清潔的表面、物品或織物，以及針對使 用過程中的清潔條件的組合物的所希望的形式而容易地具體選擇清潔組合物材料。這些術(shù) 語進(jìn)一步是指適于清潔、漂白、消毒、和/或滅菌任何物品和/或表面的任何組合物。其意 圖是，這些術(shù)語包括但不限于洗滌劑組合物（例如，液體和/或固體衣物洗滌劑和精細(xì)織物 洗滌劑；硬表面清潔配制品，如用于玻璃、木材、陶瓷和金屬臺面以及窗戶；地毯清潔劑；爐 灶清潔劑；織物清新劑；織物柔軟劑；和紡織品和衣物預(yù)去污劑，以及餐具洗滌劑）。
[0067] 除非另有說明，術(shù)語"洗滌劑組合物"包括顆粒狀或粉狀的全效或重垢清洗劑，尤 其是清潔洗滌劑；液體、凝膠或糊狀的全效清洗劑，尤其是所謂的重垢液（HDL)類型；液體 細(xì)薄織物洗滌劑；手洗餐具清洗劑或輕垢餐具清洗劑，尤其是高泡沫型的那些；洗碗機(jī)洗 碗劑，包括用于居家及機(jī)構(gòu)使用的多種片型、顆粒型、液體型以及沖洗助劑型；液體清潔和 消毒劑，包括抗菌洗手液類型、清潔棒、漱口液、義齒清潔劑、汽車或地毯清潔劑、浴室清潔 劑；洗發(fā)香波和護(hù)發(fā)素；沐浴露、沐浴露；金屬清洗劑；以及清潔助劑，如漂白劑添加劑和 "去污棒"或預(yù)處理類型。
[0068] 就預(yù)期用于臟物體和紡織品清潔的洗滌介質(zhì)中的混合物而言，使用術(shù)語"洗滌劑 組合物"和"洗滌劑配制品"。在某些實(shí)施例中，就洗滌織物和/或衣服而言，使用該術(shù)語 (例如，"衣物洗滌劑"）。在替代的實(shí)施例中，該術(shù)語是指例如用于清潔餐具、刀具等等的那 些的其他洗滌劑（例如"餐具清洗洗滌劑"）。它并不意圖使本發(fā)明限于任何特定的洗滌劑 配制品或組合物。其意圖是，除了根據(jù)本發(fā)明的葉綠素酶以外，該術(shù)語涵蓋了包含以下各項(xiàng) 的洗絳劑：例如表面活性劑、助洗劑、螯合劑（chelator)或螯合試劑（chelatingagent)、 漂白系統(tǒng)或漂白組分、聚合物、織物調(diào)理劑、增泡劑、抑泡劑、染料、香料、晦暗抑制劑、光增 亮劑、殺細(xì)菌劑、殺真菌劑、污垢懸浮劑、防腐蝕劑、酶抑制劑或穩(wěn)定劑、酶激活劑、一種或多 種轉(zhuǎn)移酶、水解酶、氧化還原酶、上藍(lán)劑和熒光染料、抗氧化劑、以及增溶劑。
[0069] 術(shù)語"織物"涵蓋任何紡織材料。因此，其意圖是，該術(shù)語涵蓋衣服，連同織物、紗 線、纖維、非織造材料、天然材料、合成材料以及任何其他紡織材料。
[0070] 術(shù)語"紡織