一種新型諾西肽衍生物及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于新型抗生素及其衍生物生物合成領(lǐng)域，具體涉及采用諾西肽核心吡啶 環(huán)合成蛋白NosO體外生物合成一種線性未形成大環(huán)結(jié)構(gòu)的新型諾西肽衍生物，以及其純 化制備和結(jié)構(gòu)鑒定。
【背景技術(shù)】
[0002] 自從1928年青霉素被發(fā)現(xiàn)以來，抗生素被應(yīng)用于許多以前致命性的疾病治療，為 人類健康事業(yè)做出了卓越的貢獻，據(jù)統(tǒng)計資料顯示，今天人類的壽命較上世紀初增加了近 20歲之多，其中約有10歲得益于抗生素的使用。但是，也因為抗生素的廣泛使用帶來了一 些嚴重問題。微生物對抗生素的抵抗力也隨著抗生素的頻繁使用變得越來越強，如臨床上 已經(jīng)出現(xiàn)了越來越多的耐藥菌株，甚至導(dǎo)致多重耐藥菌及超級細菌出現(xiàn)，原本能夠治療的 疾病從新威脅了人類的健康。因此，尋找并開發(fā)一些結(jié)構(gòu)新穎、抗菌活性強、市場前景好的 抗生素成為人們的迫切需要。
[0003] 隨著耐藥性問題的日益突出，單純依靠從自然界中篩選新型天然產(chǎn)物變得越來越 困難，已經(jīng)不能滿足各種疾病的治療需求。在目前已上市的藥物中，多數(shù)都是由天然產(chǎn)物半 合成后得到的修飾產(chǎn)物發(fā)展而成藥，純粹的天然產(chǎn)物成藥性是非常低的。但是天然產(chǎn)物的 化學(xué)結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜，采用現(xiàn)有的化學(xué)合成與修飾都很難在現(xiàn)有基礎(chǔ)上有大的突破。而隨著 分子生物技術(shù)的不斷發(fā)展以及第二代測序技術(shù)的廣泛運用，大量的微生物基因組已經(jīng)被測 序，越來越多的次級代謝產(chǎn)物的生物合成基因簇被發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)新的生物合成機制。通過組合 生物學(xué)或合成生物學(xué)的方法對很多天然產(chǎn)物的生物合成途徑進行改造，產(chǎn)生了一系列的新 的非天然的天然產(chǎn)物，制備結(jié)構(gòu)類似物或許更具有優(yōu)勢。
[0004] 隨著研宄的深入，一類結(jié)構(gòu)新穎，抗菌活性強的抗生素進入人們的視野，它們就是 硫肽類抗生素。硫肽類抗生素是一類由微生物產(chǎn)生，富含硫，高度修飾的環(huán)肽類抗生素。硫 肽類抗生素對革蘭氏陽性菌具有很強的殺菌作用，在納克水平上就具有極強的體內(nèi)外殺菌 活性，而且硫肽類抗生素的抗菌機制與市場現(xiàn)有抗生素的抗菌機制不同，不受現(xiàn)有耐藥菌 耐藥性的制約。諾西肽作為硫肽類抗生素中唯一成藥的兩種抗生素之一，結(jié)構(gòu)較簡單，已成 為硫肽類抗生素研宄的模式抗生素。諾西肽的生物合成基因簇包括14個結(jié)構(gòu)基因和1個 調(diào)控基因。N0SM編碼一個13個氨基酸長度的核心肽和33個氨基酸長度的前導(dǎo)肽，最終證 明了諾西肽合成的核糖體起源，它的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性是由前體肽翻譯后修飾引起的。這一系列 的翻譯后修飾（PTM)，可以被歸納為3個階段：（1)核心大環(huán)形成前的PTMs ; (2)核心大環(huán)的 形成；（3)核心大環(huán)形成后特異的PTMs。其中核心吡啶環(huán)是硫肽類抗生素的特征標志，它的 形成機制至今仍然無法解釋。
[0005] 體外生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)，是一種在體外進行的，利用體外表達生物合成所需酶或蛋白， 回補到中間產(chǎn)物的體外催化體系中，重新完成原本在生物體內(nèi)進行的生物合成途徑的研宄 方法。這種方法可用來定性生物合成途徑中特定酶所起的特定功能，鑒定每一步生物合成 途徑的反應(yīng)底物，也可用于組合生物合成新型衍生物。
[0006] 因此，本發(fā)明利用組合生物合成的方法，通過一種全新的體外生物轉(zhuǎn)化方法得到 了一種新型的諾西肽衍生物。這種新型的諾西肽衍生物具有較多的結(jié)合修飾位點，可作為 中間體用于合成更多具有抑制細菌生長或殺死細菌活性、更佳水溶性和成藥性的諾西肽衍 生物，對抗耐藥菌抗生素的開發(fā)具有廣泛的實用價值和重要意義。
[0007]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于提供了一種新型諾西肽衍生物及其體外生物轉(zhuǎn)化制備的新方 法，以組合生物合成方式制備自然界不存在的天然產(chǎn)物，相比化學(xué)修飾方法低毒、靶向特異 性強。
[0009] 本發(fā)明的主要技術(shù)方案為：以nosO敲除的活躍鏈霉菌產(chǎn)生的線性中間體IM為底 物，利用重組表達的NosO進行體外生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)，生成了一種新的諾西肽衍生物，并提取 和結(jié)構(gòu)鑒定。首次發(fā)現(xiàn)新型諾西肽衍生物，其分子量為1297,分子式C 54H51N13014S6，其結(jié)構(gòu)式 為：
【主權(quán)項】
1. 一種新型諾西肽衍生物，其特征在于：新型諾西肽衍生物具有下式結(jié)構(gòu)或其藥學(xué)上 可接受的鹽、酯、對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體或混合物：
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種新型諾西肽衍生物的制備方法，其特征在于包括如下步 驟： (1)采用同源雙交換法構(gòu)建nosO基因敲除活躍鏈霉菌株，分子生物學(xué)手段構(gòu)建nosO異 源表達表達菌株；(2)以nosO基因敲除活躍鏈霉菌株的發(fā)酵粗提物為底物，利用步驟（1) 中異源表達的NosO進行體外轉(zhuǎn)化反應(yīng)；（3)將步驟（2)得到的反應(yīng)產(chǎn)物進行提取純化和結(jié) 構(gòu)鑒定。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的新型諾西肽衍生物的制備方法，其特征在于所述步驟（1)構(gòu) 建nosO基因敲除菌的方法為屬間結(jié)合轉(zhuǎn)移法，nosO基因表達菌為大腸桿菌BL21，表達條件 為誘導(dǎo)劑IPTG濃度為0? 001-2mM(優(yōu)選0? 5mM)，誘導(dǎo)溫度為10~37°C(優(yōu)選20°C)誘導(dǎo) 培養(yǎng)8-24h(優(yōu)選20小時）。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的新型諾西肽衍生物的制備方法，其特征在于所述步驟（2)所 用的催化劑為含NosO蛋白的大腸桿菌破細胞上清，反應(yīng)輔助液為△nosO菌株細胞提取液， 反應(yīng)pH為2-10,優(yōu)選7,反應(yīng)時間大于2小時，優(yōu)選24小時。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述新型諾西肽衍生物的制備方法備，其特征在于步驟（3)使用乙 酸乙酯提取諾西肽衍生物，反相柱純化獲得全新結(jié)構(gòu)的諾西肽衍生物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的諾西肽衍生物作為中間體用于合成更多具有較好抑菌活性 和水溶性更好的新型諾西肽化合物中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種新型諾西肽衍生物及其制備方法。本發(fā)明的特點是以nosO敲除菌發(fā)酵產(chǎn)物IM為底物，利用重組nosO和輔助反應(yīng)液ΔnosO菌株的細胞提取物，進行體外生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)，再分離純化得到一種新型的諾西肽衍生物，其分子量為1297，分子式C54H51N13O14S6。本發(fā)明提供的諾西肽衍生物具有較多活性基團，可作為中間體用于合成更多具有抑菌活性和水溶性更好的諾西肽衍生物。
【IPC分類】C12N15-70, C12R1-465, C12N15-76, C12R1-19, A61P31-04, C12P21-02, C07K5-097
【公開號】CN104844689
【申請?zhí)枴緾N201510198618
【發(fā)明人】陳依軍, 許南兒, 吳旭日
【申請人】中國藥科大學(xué)
【公開日】2015年8月19日
【申請日】2015年4月23日