一株高效降解鄰苯二甲酸二丁酯的普羅威登斯菌(Providencia sp.)2D的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及環(huán)境污染物生物處理技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一株高效且能完全降 解鄰苯二甲酸二丁醋的普羅威登斯菌sp. )2D。
【背景技術(shù)】
[0002] 鄰苯二甲酸二丁醋（di-/?-butylphthalate，DBP)屬于鄰苯二甲酸醋類化合物 (Phthalic acidester，PAEs)，是塑料工業(yè)最主要的增塑劑之一，也是農(nóng)藥、染料去污劑的 載體以及諸多化妝品、紡織品的生產(chǎn)原料，廣泛用于食品包裝材料、容器、醫(yī)療器械以及兒 童玩具等領(lǐng)域。由于上述制品的大量應(yīng)用，DBP已經(jīng)成為全球性的有機(jī)污染物，廣泛存在于 大氣、水體、土壤以及生物體中。特別是在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，由于塑料薄膜和塑料大棚的廣泛應(yīng) 用，殘留在農(nóng)業(yè)土壤中DBP極易通過(guò)食物鏈在人體中富集。DBP及其代謝物能夠?qū)C(jī)體造 成生殖毒性、發(fā)育毒性、神經(jīng)毒性、多器官癌變等多種損傷，因此美國(guó)環(huán)保署（EPA)和中國(guó)國(guó) 家環(huán)境監(jiān)測(cè)中心（CNEMC)都已將它列為優(yōu)先控制污染物。
[0003] 研宄表明，DBP的水解和光解速率都非常緩慢，生物降解是其在環(huán)境中分解的主要 途徑。因此，獲得DBP高效降解菌是提高其生物降解效率的重要環(huán)節(jié)。利用微生物降解作 用，將DBP轉(zhuǎn)化為無(wú)害物質(zhì)或完全礦化，是公認(rèn)的去除環(huán)境中DBP污染的最佳手段。由于環(huán) 境中DBP的普遍存在，DBP降解菌的出現(xiàn)頻率也很高，目前對(duì)DBP有降解作用的微生物大多 數(shù)為戈登氏菌屬、農(nóng)桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬和赤紅球菌屬等，但已報(bào)道的這些細(xì)菌對(duì)于DBP的 生物降解不完全，會(huì)產(chǎn)生毒性更高的中間代謝產(chǎn)物，或者其降解速率還不能滿足實(shí)際污染 控制的要求，因此仍需篩選更加高效的專性或兼性降解菌。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一株高效且能完全降解鄰苯二甲酸二 丁酯的菌株。
[0005] 本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)的： 一株普羅威登斯菌sp. ) 2D，所述菌株于2015年1月22日保藏在中國(guó) 典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)，保藏編號(hào)為CCTCC M 2015057;保藏地址為：中國(guó)武漢武漢 大學(xué)。 所述菌株/sp. 2D通過(guò)富集培養(yǎng)法從農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物奠堆肥樣品中富集獲得，該 菌的最適生長(zhǎng)條件為：溫度30~40°C，pH為7. 0~8.5。
[0006] 所述菌株/sp. 2D在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（LB，酵母粉5. 0 g，蛋白 胨10. 0 g，氯化鈉10. 0 g，pH= 7. 0)上劃線培養(yǎng)7天，菌落呈橘黃色，質(zhì)地膏狀，豐厚濕潤(rùn)， 易被挑起，邊緣較?。粧呙桦娮语@微鏡下該菌株呈長(zhǎng)桿狀，長(zhǎng)約1. 5~3. 0 y m，寬約0. 5~ 0. Sum。經(jīng)革蘭氏染色鑒定該菌為革蘭氏陰性菌。
[0007] 所述菌株/sp. 2D的生理生化鑒定實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：甲基紅試驗(yàn)（陽(yáng) 性)、V-P試驗(yàn)（陰性)、吲哚反應(yīng)（陽(yáng)性)、檸檬酸鹽利用（陽(yáng)性)、肌醇產(chǎn)酸試驗(yàn)（陽(yáng)性)、葡萄糖 產(chǎn)酸試驗(yàn)（陽(yáng)性)、淀粉水解試驗(yàn)（陰性)、尿酶試驗(yàn)（陽(yáng)性)、明膠液化試驗(yàn)（陰性)、硝酸鹽還原 (陽(yáng)性)、氧化酶試驗(yàn)（陰性）和葡萄糖產(chǎn)氣試驗(yàn)（陰性)。
[0008] 所述菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO :1所示，通過(guò)NCBI官方網(wǎng)站（hi:tp://www. ncbi. nlm. nih. gov/)的BLAST程序與其他已登錄細(xì)菌菌株的16S rDNA序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果 表明該菌株與sp.相似性最高，同源率達(dá)99%。
[0009] 所述菌株/sp. 2D能夠利用DBP作為唯一碳源和能源生長(zhǎng)繁殖，并將 DBP完全礦化。
[0010] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果： 本發(fā)明提供了一株普羅威登斯菌sp. 2D，該菌株活力高，在72 h對(duì)高濃 度的DBP (1000 mg/L)降解效率超過(guò)80%，對(duì)低濃度的DBP (200 mg/L)幾乎完全降解；該 菌株還能夠降解DBP的中間產(chǎn)物鄰苯二甲酸，所述菌株具有高效的DBP降解能力，同時(shí)具有 生長(zhǎng)速度快、培養(yǎng)方法簡(jiǎn)單、適應(yīng)能力強(qiáng)、不易變異的特點(diǎn)，極大地補(bǔ)充了 DBP降解菌的資 料庫(kù)，具有良好的應(yīng)用前景。
【附圖說(shuō)明】
[0011] 圖1為Providencia sp. 2D在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天的生長(zhǎng)形態(tài)。
[0012] 圖2為/sp. 2D的掃描電鏡圖。
[0013] 圖3為/￥〇成sp. 2D的16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。
[0014] 圖4為/sp. 2D對(duì)DBP和鄰苯二甲酸的降解動(dòng)力學(xué)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 下面結(jié)合說(shuō)明書(shū)附圖和具體實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本 發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的簡(jiǎn)單 修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍；若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù) 人員所熟知的常規(guī)手段。
[0016] 實(shí)施例1鄰苯二甲酸二丁酯降解菌的分離與鑒定 1、培養(yǎng)基配方 無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液（MSM，g/L):K2HP04:5. 8 ;KH2P04:4. 5 ; (NH4)2S04:2. 0 ;MgCl 2:0.1 6 ;CaCl 2: 0? 02 ;Na2Mo04 ? 2H20 :0? 0024 ;FeCl3:0. 0018 ;MnCl 2 ? 2H20 :0? 0015 ;調(diào)節(jié)無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液的最 終pH為7. 5,添加DBP，使其在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液中的濃度為50 mg/L，DBP作為唯一碳源。
[0017] 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（LB):酵母粉5.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化鈉10.0 g，加超純 水至1L，調(diào)節(jié)pH= 7. 0。121°C滅菌20分鐘。固體平板則添加1. 5% (W/V)瓊脂粉。
[0018] 2、分離與鑒定 分離方法采用樣品懸液搖瓶法：稱取5 g堆肥樣品（取自農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物堆肥）于含有50 mL 無(wú)菌水的150 mL三角瓶中，在30°C，140 rpm條件下培養(yǎng)3天后取5 mL堆肥懸液加入100 mL含DBP (50 mg/L)的上述MSM培養(yǎng)基中。經(jīng)30°C，140 rpm培養(yǎng)7天后，每次按取1 mL 的接種量連續(xù)富集、轉(zhuǎn)接10次，并相應(yīng)提高M(jìn)SM培養(yǎng)基中DBP含量至1000 mg/L(第二次轉(zhuǎn) 接，MSM培養(yǎng)基中DBP的含量為100mg/L，之后每轉(zhuǎn)接一次，MSM培養(yǎng)基中DBP的含量相應(yīng)提 高100mg/L)。然后將轉(zhuǎn)接10次的培養(yǎng)液稀釋103~10 5涂布于LB固體平板上，30°C倒置 培養(yǎng)1~3天。待平板上長(zhǎng)出單菌落后，挑取單菌落多次劃線純化，分離獲得一株細(xì)菌，編 號(hào)為2D。然后將菌株接種于LB固體平板上30°C倒置培養(yǎng)7天，觀察其菌落形態(tài)。LB平板 培養(yǎng)7天的菌落呈橘黃色，質(zhì)地膏狀，豐厚濕潤(rùn)，易被挑起，邊緣較薄(見(jiàn)圖1 )。
[0019] 掃描電鏡樣品制備與觀察：將菌種2D的單菌落接入含有10 mL的LB液體培養(yǎng)基 過(guò)夜活化。吸取800 yL菌液經(jīng)8000 rpm離心3~5 min，去上清液，加入500 yL PBS 洗菌3次。在收獲的菌體沉淀中加入1 mL 2.5% (v/v)戊二醛充分混勻，4°C靜置過(guò)夜。然 后再次經(jīng)8000 rpm離心3~5 min，去上清液，加入500 yL PBS洗菌3次。隨后將菌體 分別在30%，50%，70%，85%，90%和100%的梯度乙醇中脫水2次，每個(gè)梯度約浸泡15 min，然 后8000 rpm離心去上清液，最后用乙酸異戊酯置換乙醇2次，每次20 min，方法同乙醇脫 水。菌體經(jīng)過(guò)〇)2干燥后制片觀察。掃描電鏡下可以觀察到該菌呈長(zhǎng)桿狀，長(zhǎng)約1.5~3.0 ym，寬約0.5~0.8 ym (見(jiàn)圖2)。
[0020] 菌株的生理生化鑒定指標(biāo)包括12項(xiàng)：甲基紅試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、吲哚反應(yīng)、檸檬酸鹽 利用、肌醇產(chǎn)酸試驗(yàn)、葡萄糖產(chǎn)酸試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、尿酶試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、硝酸鹽還 原、氧化酶試驗(yàn)和葡萄糖產(chǎn)氣試驗(yàn)。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。
[0021]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一株普羅威登斯菌（sp. )2D，其特征在于，所述菌株于2015年1月22 日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)，保藏編號(hào)為CCTCCM2015057。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的菌株，其特征在于，所述菌株的16SrDNA序列如SEQIDNO: 1所示。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的菌株，其特征在于，所述菌株為革蘭氏陰性菌；在LB培養(yǎng)基 上菌落呈橘黃色，質(zhì)地膏狀，豐厚濕潤(rùn)，易被挑起，邊緣較薄。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的菌株，其特征在于，所述菌株能將鄰苯二甲酸二丁酯完全礦 化。
【專利摘要】本發(fā)明屬于環(huán)境污染物生物處理技術(shù)領(lǐng)域，具體公開(kāi)了一株高效且能完全降解鄰苯二甲酸二丁酯的普羅威登斯菌（Providencia sp.）2D，所述菌株于2015年1月22日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），保藏編號(hào)為CCTCC M 2015057。該菌株在72h對(duì)高濃度的DBP（1000mg/L）降解效率超過(guò)80%，對(duì)低濃度的DBP（200mg/L）幾乎完全降解；該菌株還能夠降解DBP的中間產(chǎn)物鄰苯二甲酸，最終將DBP完全礦化，所述菌株具有高效的DBP降解能力，極大地補(bǔ)充了DBP降解菌的資料庫(kù)，該菌還具有生長(zhǎng)速度快、培養(yǎng)方法簡(jiǎn)單、適應(yīng)能力強(qiáng)、不易變異的特點(diǎn)，具有良好的應(yīng)用前景。CCTCC M 201505720150122
【IPC分類】C12N1-20, C12R1-01
【公開(kāi)號(hào)】CN104845898
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510066060
【發(fā)明人】莫測(cè)輝, 趙海明, 蔡全英, 李彥文, 李慧, 馮乃憲, 杜歡, 喻嬌
【申請(qǐng)人】暨南大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年8月19日
【申請(qǐng)日】2015年2月9日