赤桿菌及其在降解十溴聯(lián)苯醚中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物應(yīng)用領(lǐng)域，具體是涉及赤桿菌及其在降解十溴聯(lián)苯醚中的應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002]多溴聯(lián)苯醚（polybrominated diphenyl ethers, PBDEs)是一類的溴系阻燃劑，被 廣泛應(yīng)用于電子、電器、化工、紡織以及建筑等領(lǐng)域。PBDEs主要的工業(yè)產(chǎn)品有三種：五溴聯(lián) 苯醚（Penta-BDE)、八溴聯(lián)苯醚（Octa-BDE)、十溴聯(lián)苯醚（Deca-BDE)。其中含溴量最高的 十溴聯(lián)苯醚是目前市場上需求量最大的一類。十溴聯(lián)苯醚為一種非反應(yīng)添加型阻燃劑，由 于缺少化學鍵的束縛，在生產(chǎn)、運輸、使用以及廢棄物處理等過程中很容易釋放到環(huán)境介質(zhì) 中。且十溴聯(lián)苯醚具有環(huán)境持久性、生物易積累性及疏水親脂性等特點，易吸附于顆粒物和 沉積物中，并可以在環(huán)境中長距離迀移，在土壤、水體（及沉積物）、大氣、及各類生物體（人 體、魚類、貝類等）等各種環(huán)境介質(zhì)中均有檢出。目前，五溴聯(lián)苯醚和八溴聯(lián)苯醚被禁用，而 十溴聯(lián)苯醚在今后的一段時間內(nèi)仍將被大量生產(chǎn)和使用，且有逐年增加的趨勢。實驗數(shù)據(jù) 表明，十溴聯(lián)苯醚具有潛在的致癌性以及對子代免疫功能產(chǎn)生影響等。十溴聯(lián)苯醚在各種 環(huán)境介質(zhì)中的長期積累，已經(jīng)對環(huán)境及生物健康構(gòu)成巨大的威脅。因此，十溴聯(lián)苯醚的降解 研宄已成為環(huán)保工作者關(guān)注的熱點問題之一。
[0003] 關(guān)于十溴聯(lián)苯醚的降解方法主要有零價鐵還原法、光降解法和微生物降解法等。 微生物降解方法包括微生物厭氧降解和微生物好氧降解。厭氧降解主要為還原脫溴的過 程，即不斷脫去溴原子而產(chǎn)生低溴代聯(lián)苯醚，再進一步降解，該過程所需時間較長。而好氧 降解則主要為共代謝作用，耗時較短、降解效率高。因為十溴聯(lián)苯醚好氧降解的研宄處于初 始階段，相關(guān)的研宄報道較少，所以篩選高效的十溴聯(lián)苯醚好氧降解菌并探討其降解特性， 對于十溴聯(lián)苯醚的環(huán)境污染處理具有重要的科學意義和應(yīng)用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供赤桿菌（Erythrobacter sp.)TAW-CT125。
[0005] 本發(fā)明的另一目的在于提供赤桿菌（Erythrobacter sp. )TAW-CT125在降解十溴 聯(lián)苯醚中的應(yīng)用。
[0006] 所述赤桿菌（Erythrobacter sp.) TAW-CT125,已于2015年4月8日保藏于中國 典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：中國武漢武漢大學，郵編：430072,保藏中心保藏編號為CCTCC NO. M 2015210。
[0007] 所述赤桿菌（Erythrobacter sp.)TAW-CT125是從福建省廈門市近海表層沉積物 (E118° 1CT，N24° 3Y )中分離篩選得到，屬于赤桿菌科（Erythrobacteraceae)。
[0008]赤桿菌（Erythrobacter sp. )TAW_CT125的富集篩選采用等濃度添加污染物 作為其生長的唯一碳源，在人工海水培養(yǎng)基MMC(NaCl 24g/L，NH4N03lg/L，KCl 0. 7g/L， KH2P042. 0g/L，Na2HP043. 0g/L，pH 7. 4, MgS047g/L)中加入十溴聯(lián)苯醚-二氯甲烷溶液 及微量元素（CaCl 2mg/L，F(xiàn)eCl3 ? 6H20 50mg/L，CuS040. 5mg/L，MnCl2 ? ? H20 0? 5mg/L， ZnS04 ? ? 7H20 lOmg/L)，十溴聯(lián)苯醚濃度為100mg/L，pH7. 4。該菌落為圓形，邊緣規(guī)則整齊， 橙色，光滑，濕潤，凸起；菌體呈短桿狀，革蘭氏染色陰性。
[0009] 所述赤桿菌（Erythrobacter sp.) TAW-CT125可在降解十溴聯(lián)苯醚中應(yīng)用。
[0010] 所述降解十溴聯(lián)苯醚的方法可為：將赤桿菌（Erythrobacter sp. )TAW_CT125接 種于十溴聯(lián)苯醚為唯一碳源的液體培養(yǎng)基中，避光條件下置于搖床中富集培養(yǎng)。
[0011] 所述十溴聯(lián)苯醚降解培養(yǎng)基DM (Degradation Medium)是人工海水培養(yǎng)基 MMC(NaCl 24g/L，NH4N03lg/L，KCl 0.7g/L，KH2P042.0g/L，Na2HP043.0g/L，pH 7.4，MgS047g/ L)中加入十溴聯(lián)苯醚-二氯甲烷溶液及微量元素（CaCl 2mg/L，F(xiàn)eCl3,6H20 50mg/L， CuS040. 5mg/L，MnCl2 ? ? H20 0? 5mg/L，ZnS04 ? ? 7H20 10mg/L)，十溴聯(lián)苯醚濃度為 50mg/L， pH7. 4。
[0012] 所述降解條件為pH7. 4,溫度為28°C，搖床的轉(zhuǎn)動速率為160rpm。
[0013] 所述十溴聯(lián)苯醚降解培養(yǎng)基DM中十溴聯(lián)苯醚為唯一碳源。
[0014] 培養(yǎng)物經(jīng)GC-MSD測定，可分析該菌株對十溴聯(lián)苯醚的降解效果，在以十溴聯(lián)苯醚 為唯一碳源的情況下，該菌株對十溴聯(lián)苯醚具有一定的降解作用。
[0015] 本發(fā)明的有益效果如下：
[0016] 本發(fā)明的赤桿菌（Erythrobacter sp.) TAW-CT125 在 pH7. 4, 28°C，搖床的轉(zhuǎn)動頻 率為160rpm，在以十溴聯(lián)苯醚為唯一碳源的降解培養(yǎng)基中培養(yǎng)8天，該菌對十溴聯(lián)苯醚的 降解率達到85%。
【附圖說明】
[0017] 圖1為基于AW-CT125菌株的16S rRNA序列所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹。
[0018] 圖2為BDE-209甲苯-異辛烷混合溶液（v/v = 1 : 9)標準溶液總離子流色譜圖。
[0019]圖 3 為 BDE-209 特征圖譜（m/z)。
【具體實施方式】
[0020] 下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。
[0021] 實施例一
[0022] 一、赤桿菌（Erythrobacter sp. ) TAW-CT125 的分離和鑒定
[0023] 1、赤桿菌（Erythrobacter sp. )TAW-CT125 的富集、分離和純化 [0024] 培養(yǎng)基：
[0025] 人工海水培養(yǎng)基（MMC):每升培養(yǎng)基中含有NaCl 24g，NH4N03lg，KC1 0. 7g， KH2P042. 0g，Na2HP043. 0g，pH 7. 4, MgS047g (滅菌后加入）。
[0026] 微量元素鹽溶液：每升微量元素鹽溶液中含有CaCl 2mg，F(xiàn)eCl3 ? 6H20 50mg， CuS040. 5mg，MnCl2 ? ? H20 0? 5mg，ZnS04 ? ? 7H20 10mg。
[0027] 海生菌瓊脂2216培養(yǎng)基和海生菌肉湯2216培養(yǎng)基購買于碧迪醫(yī)療器械（上海） 有限公司。
[0028] 十溴聯(lián)苯醚母液：有機溶劑二氯甲烷，濃度為lg/L。
[0029] 本發(fā)明的赤桿菌（Erythrobacter sp. )TAW_CT125是從廈門附近海域所采集的表 層沉積物經(jīng)富集、分離、純化而得。
[0030] 樣品富集及單菌株分離純化方法：取3~5g沉積物樣品添加于含有100mL培養(yǎng) 基（人工海水培養(yǎng)基+微量元素鹽溶液）的250mL的三角燒瓶中，加入十溴聯(lián)苯醚作為菌 株生長所需要的唯一碳源，濃度為l〇〇mg/L。把三角燒瓶用錫箔紙做避光處理，置于28°C、 160rpm搖床中震蕩培養(yǎng)。震蕩培養(yǎng)分4個階段，每階段的時間為4w，四個階段的不同之處 為在第一階段的富集培養(yǎng)基中加入5mL海生菌肉湯2216培養(yǎng)基，為菌體生長提供豐富的營 養(yǎng)物質(zhì)，而第二、三、四階段未添加該培養(yǎng)基。取lmL上一階段的富集培養(yǎng)液作為下一階段 的菌種來源接種到新的培養(yǎng)基中。待第四階段富集培養(yǎng)結(jié)束后，取lmL第四階段的富集培 養(yǎng)液，用無菌超純水進性10倍梯度稀釋，然后取1〇_ 5~10 _7倍的稀釋液涂布于海生菌瓊脂 2216平板培養(yǎng)基上。涂布后的平板置于28°C恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)5天，從平板上挑出不 同形態(tài)的單菌落，在海生菌瓊脂2216十溴聯(lián)苯醚平板培養(yǎng)基上劃線純化，收集部分菌體用 于提取DNA，同時保藏菌種。
[0031] 赤桿菌（Erythrobacter sp. )TAW-CT125的獲得：100mL培養(yǎng)基（人工海水培養(yǎng)基 +微量元素鹽溶液），以十溴聯(lián)苯醚（50mg/L)為唯一碳源的培養(yǎng)基作為實驗組，不加十溴聯(lián) 苯醚的培養(yǎng)基作為對照組，實驗組和對照組設(shè)立三個重復組。接入純化后的單菌株，使培養(yǎng) 基的0D600值在0. 23~0. 25范圍內(nèi)。將接種后的實驗組和對照組置于28°C、160rpm的搖 床中震蕩培養(yǎng)（培養(yǎng)基做避光處理）。培養(yǎng)5d后，取富集培養(yǎng)液，0D600條件下測得吸光 值。且通過肉眼觀察最終獲得十溴聯(lián)苯醚降解菌株，實驗中的編號為TAW-CT125。
[0032] 2、菌株的鑒定
[0033] (1)菌體及菌落的形態(tài)特征：
[0034] 采用常規(guī)的細菌生理生化鑒定方法和電子顯微鏡觀察，赤桿菌（Erythrobacter sp.)TAW-CT125的細胞為革蘭氏陰性，在2216E固體平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)48h，菌落形態(tài)為圓 形，邊緣整齊，橙色，光滑，濕潤，凸起，菌落直徑為1~1. 5_。
[0035] (2)菌體的遺傳特征：
[0036]通過對赤桿菌（Erythrobacter sp.) TAW-CT125 的 16S rRNA 序列測定和在 Ez-biocloud網(wǎng)站上進行同源性分析，該序列與模式菌株Erythrobacter odishensis 從747〇')冊680094的163冰隱序列的同源性達到98.89%。根據(jù)菌株命名法則，菌株 TAW-CT125屬于赤桿菌屬，被命名為赤桿菌（Erythrobacter sp.)TAW_CT125?；诔鄺U 菌（Erythrobacter sp.)TAW_CT125的16S rRNA序列所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1。赤桿菌 (Erythrobacter sp.)TAW_CT125 的 16S rRNA 序列如下：
[0037]
【主權(quán)項】
1?赤桿菌（Erythrobactersp.)TAW_CT125,已于2015年4月8日保藏于中國典型培 養(yǎng)物保藏中心，保藏中心保藏編號為CCTCCNO.M2015210。
2.如權(quán)利要求1所述赤桿菌（Erythrobactersp. )TAW-CT125的富集篩選方法，其特 征在于采用等濃度添加污染物作為其生長的唯一碳源，在人工海水培養(yǎng)基MMC中加入十溴 聯(lián)苯醚-二氯甲烷溶液及微量元素，十溴聯(lián)苯醚濃度為l〇〇mg/L，pH7.4 ;該菌落為圓形，邊 緣規(guī)則整齊，橙色，光滑，濕潤，凸起；菌體呈短桿狀，革蘭氏染色陰性；所述人工海水培養(yǎng) 基MMC的組成為：NaCl 24g/L，NH4NO3 lg/L，KCl 0? 7g/L，KH2PO4 2. Og/L，Na2HPO4 3. Og/L， pH 7.4,MgSO4 7g/L;所述微量元素包括CaCl 2mg/L，F(xiàn)eCl3 ? 6H20 50mg/L，CuSO4 0? 5mg/L， MnCl2 ?? H2O 0? 5mg/L，ZnSO4 ?? 7H20 10mg/L。
3. 如權(quán)利要求I所述赤桿菌（Erythrobactersp. )TAW_CT125在降解十溴聯(lián)苯醚中應(yīng) 用。
4. 如權(quán)利要求3所述應(yīng)用，其特征在于所述降解十溴聯(lián)苯醚的方法為：將赤桿菌 (Erythrobactersp.)TAW-CT125接種于十溴聯(lián)苯醚為唯一碳源的液體培養(yǎng)基中，避光條件 下置于搖床中富集培養(yǎng)；降解的條件為PH7. 4,溫度為28°C，搖床的轉(zhuǎn)動速率為160rpm。
【專利摘要】赤桿菌及其在降解十溴聯(lián)苯醚中的應(yīng)用，涉及微生物應(yīng)用領(lǐng)域。赤桿菌(Erythrobacter sp.)TAW-CT125，保藏編號為CCTCC NO.M2015210。赤桿菌(Erythrobacter sp.)TAW-CT125可在降解十溴聯(lián)苯醚中應(yīng)用。降解十溴聯(lián)苯醚的方法：將赤桿菌(Erythrobacter sp.)TAW-CT125接種于十溴聯(lián)苯醚為唯一碳源的液體培養(yǎng)基中，避光條件下置于搖床中富集培養(yǎng)。赤桿菌(Erythrobacter sp.)TAW-CT125在pH7.4，28℃，搖床的轉(zhuǎn)動頻率為160rpm，在以十溴聯(lián)苯醚為唯一碳源的降解培養(yǎng)基中培養(yǎng)8天，該菌對十溴聯(lián)苯醚的降解率達到85％。CCTCC NO.M201521020150408
【IPC分類】C12R1-02, A62D3-02, A62D101-28, C12N1-20
【公開號】CN104845911
【申請?zhí)枴緾N201510264759
【發(fā)明人】邵宗澤, 王萬鵬, 蔡慶濤, 趙苒
【申請人】國家海洋局第三海洋研究所
【公開日】2015年8月19日
【申請日】2015年5月22日