一種乳酸乳球菌及利用其同時(shí)生產(chǎn)乳酸鏈球菌素和乳酸片球菌素的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，確切地說是一種乳酸乳球菌及利用其同時(shí)生產(chǎn)乳酸鏈球菌素和乳酸片球菌素的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]細(xì)菌素是某些細(xì)菌產(chǎn)生的一種蛋白類抗菌物質(zhì)，作為食品防腐劑具有高效、無毒、耐酸、耐高溫、無殘留、無抗藥性等優(yōu)點(diǎn)。其中從乳酸菌中分離的細(xì)菌素主要有乳酸鏈球菌素(Nisin)和乳酸片球菌素(Ped1cin)，由于它們較強(qiáng)的抗食源性致病菌和腐敗菌活性而被廣泛關(guān)注。
[0003]Nisin是由某些乳酸乳球菌產(chǎn)生的一種含34個(gè)氨基酸的多肽物質(zhì)，對(duì)許多革蘭氏陽性菌包括葡萄球菌、鏈球菌、芽孢桿菌屬等有強(qiáng)烈抑制作用。Ni sin的熱穩(wěn)定性、耐酸、耐低溫保藏，沒有生長(zhǎng)刺激作用及其對(duì)食物的色香味沒有不良影響。Nisin是開發(fā)成功的一個(gè)例子，目前世界上包括我國在內(nèi)已有50多個(gè)國家許可Nisin作為食品防腐劑。
[0004]Ped1cin是乳酸片球菌產(chǎn)生的具有抑菌活性的小分子多肽，屬于II類細(xì)菌素，能有效抑制利斯特氏菌以及其它革蘭氏陰性菌。乳酸片球菌素具有較寬的PH耐受性和對(duì)低溫與高溫的耐受性，并且乳酸片球菌素天然、安全、無毒副作用。Ped1cin可以單獨(dú)用在食品防腐和醫(yī)療上，也可以與Nisin互相補(bǔ)充，增強(qiáng)抑菌效果，具有極高的使用價(jià)值和應(yīng)用前景。
[0005]乳酸乳球菌是一類食品級(jí)微生物，無內(nèi)毒素，可用現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)在廉價(jià)的培養(yǎng)基中進(jìn)行工業(yè)規(guī)模的培養(yǎng)，此外，乳酸乳球菌具有分泌蛋白質(zhì)的能力，使許多同源蛋白質(zhì)可表面表達(dá)或分泌出胞外，是細(xì)菌素表達(dá)的好宿主菌，但乳酸乳球菌異源表達(dá)Ped1cin時(shí)，由于分泌系統(tǒng)不能有效識(shí)別Ped1cin原有的前導(dǎo)肽序列，導(dǎo)致不能將Ped1cin前體有效分泌出胞外得到活性Ped1cin。目前尚未見有報(bào)道乳酸乳球菌同時(shí)生產(chǎn)Nisin和Ped1cin。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明提供一種乳酸乳球菌(Lactococcus lactis) SZ325，并利用該乳酸乳球菌同時(shí)產(chǎn)兩種細(xì)菌素乳酸鏈球菌素(Nisin)和乳酸片球菌素(Ped1cin)，以克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，達(dá)到為Nisin與Ped1cin共表達(dá)提供新方法，提高菌株生產(chǎn)效率，Nisin與Ped1cin互相補(bǔ)充擴(kuò)大抑菌譜的技術(shù)目的。
[0007]上述目的通過以下方案實(shí)現(xiàn):
本發(fā)明提供的一種新的乳酸乳球菌菌株，是從合肥地區(qū)生牛奶中分離，分類命名為乳酸乳球菌{Lactococcus lactis) SZ325，菌種保藏號(hào)為CGMCC N0.10613，保藏日期為2015年3月11日，保藏機(jī)構(gòu)為中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研宄所。該乳酸乳球菌能生產(chǎn)Nisin，并且對(duì)Ped1cin有天然抗性。
[0008]—種乳酸乳球菌，其特征在于:是從牛奶中分離得到的，其生產(chǎn)乳酸鏈球菌素Nisin,并且對(duì)乳酸片球菌素Ped1cin有天然抗性，命名為乳酸乳球菌SZ325，菌種保藏號(hào)為 CGMCC N0.10613。
[0009]所述的乳酸乳球菌中同時(shí)生產(chǎn)Nisin和Ped1cin的方法，其特征在于包括如下步驟:
(I)構(gòu)建含有Nisin前導(dǎo)肽序列N與Ped1cin結(jié)構(gòu)基因pedA的雜合基因N-pedA:
①人工合成一對(duì)基因特異性擴(kuò)增引物:
pnisl:50 -AACGGCTCTGATTAAATTCTGAAGTTT-30 ；
pnis2:50 -CCATTACCGTAGTATTTGCGTGGTGATGCACCTGAATC-30 ；
此兩個(gè)引物含有與Nisin自身啟動(dòng)子、前導(dǎo)肽基因兩側(cè)的兩條鏈互補(bǔ)序列，引物pnis2的50端17個(gè)核苷酸序列與pedA序列互補(bǔ)；以菌株L3ctococcus lactis SZ325的DNA為模板，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR擴(kuò)增含有啟動(dòng)子與Nisin前導(dǎo)肽基因片段；
②再人工合成一對(duì)基因特異性擴(kuò)增引物:
ppedl -M -GGTGCATCACCACGCAAATACTACGGTAATGGG-30 ；pped2 -M -TTATGATGCCAGCTCAGCATAAT-30 ；
此兩個(gè)引物含有與PedA基因兩側(cè)的兩條鏈互補(bǔ)序列，引物ppedl的50端15個(gè)核苷酸序列與Nisin前導(dǎo)肽序列互補(bǔ)；以含有ped1cin操縱子的DNA為模板，PCR擴(kuò)增pedA基因片段;
③將步驟①和②中獲得的兩擴(kuò)增片段等量混合作為二次PCR模板，以pnisl、pped2為引物，擴(kuò)增出含有啟動(dòng)子、Nisin前導(dǎo)肽與pedA的融合基因片段N-pedA ；
(2)在克隆的N-pedA基因兩端引入酶切位點(diǎn)BWII，經(jīng)純化后用限制性內(nèi)切酶BWII酶切，酶切產(chǎn)物與經(jīng)過Bg7II酶切的載體質(zhì)粒連接，再轉(zhuǎn)化菌株Lactococcus IactisSZ325 ；
(3)菌株培養(yǎng)后，即使得Nisin與Ped1cin的共表達(dá)。
[0010]所述的一種乳酸乳球菌中同時(shí)生產(chǎn)Nisin和Ped1cin的方法，其特征在于，步驟
(3)菌株培養(yǎng)后，采用NisiruPed1cin特定抗體進(jìn)行非競(jìng)爭(zhēng)性間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、N端氨基酸序列分析證實(shí)Nisin與Ped1cin的共表達(dá)。
[0011]本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明針對(duì)乳酸乳球菌異源表達(dá)Ped1cin時(shí)分泌系統(tǒng)不能有效識(shí)別Ped1cin原有的前導(dǎo)序列的問題，采用接頭重疊延伸技術(shù)，進(jìn)行二次PCR擴(kuò)增出含有Nisin前導(dǎo)肽序列與Ped1cin結(jié)構(gòu)基因的雜合基因片段，連接到載體質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化產(chǎn)Nisin的乳酸乳球菌，菌株細(xì)胞自身的Nisin分泌系統(tǒng)即可以識(shí)別并分泌兩種細(xì)菌素，細(xì)胞同時(shí)生產(chǎn)Nisin與Ped1cin。這為多細(xì)菌素共表達(dá)提供了一條嶄新的途徑。
[0012]經(jīng)測(cè)定，本發(fā)明中乳酸乳球菌生產(chǎn)Nisin和Ped1cin的產(chǎn)量都達(dá)到原對(duì)照菌株95%以上，表明兩種細(xì)菌素共表達(dá)未影響單一細(xì)菌素原有表達(dá)水平。乳酸乳球菌同時(shí)生產(chǎn)Nisin與Ped1cin，菌株生產(chǎn)效率高，而且Nisin與Ped1cin互相補(bǔ)充，擴(kuò)大了抑菌譜。
【具體實(shí)施方式】
[0013]下面用實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，有利于對(duì)本發(fā)明及其優(yōu)點(diǎn)、效果更好的了解，但所述實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明。
[0014]本發(fā)明使用的乳酸乳球菌菌株，是從合肥地區(qū)生牛奶中分離，命名為乳酸乳球菌{Lactococcus lactis) SZ325，菌種保藏號(hào)為 CGMCC N0.10613，保藏日期為 2015 年 3 月 11日，保藏機(jī)構(gòu)為中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研宄所。該乳酸乳球菌能生產(chǎn)乳酸鏈球菌素(Nisin)，并且對(duì)乳酸片球菌素(Ped1cin)有天然抗性。
[0015]實(shí)施例:
本實(shí)施例乳酸乳球菌同時(shí)產(chǎn)Nisin和Ped1cin的方法，包括通過二次PCR擴(kuò)增出含有啟動(dòng)子與Nisin前導(dǎo)基因片段、連接載體質(zhì)粒和轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌。本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】如下:
(I)構(gòu)建含有Nisin前導(dǎo)肽序列(N)與Ped1cin結(jié)構(gòu)基因(pedA)的雜合基因N-pedA:
①人工合成一對(duì)基因特異性擴(kuò)增引物:
pnisl:50 -AACGGCTCTGATTAAATTCTGAAGTTT-30 ；
pnis2:50 -CCATTACCGTAGTATTTGCGTGGTGATGCACCTGAATC-30 ；
此兩個(gè)引物含有與Nisin自身啟動(dòng)子、前導(dǎo)肽基因兩側(cè)的兩條鏈互補(bǔ)序列，引物pnis2的50端17個(gè)核苷酸序列與pedA序列互補(bǔ)；以菌株lactococcus lactis SZ325的DNA為模板，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增含有啟動(dòng)子與Nisin前導(dǎo)肽基因片段。
[0016]②再人工合成一對(duì)基因特異性擴(kuò)增引物:
ppedl -M -GGTGCATCACCACGCAAATACTACGGTAATGGG-30 ；pped2 -M -TTATGATGCCAGCTCAGCATAAT-30 ；
此兩個(gè)引物含有與PedA基因兩側(cè)的兩條鏈互補(bǔ)序列，引物ppedl的50端15個(gè)核苷酸序列與Nisin前導(dǎo)肽序列互補(bǔ)；以含有ped1cin操縱子的DNA為模板，PCR擴(kuò)增pedA基因片段。
[0017]③將步驟①和②中獲得的兩擴(kuò)增片段等量混合作為二次PCR模板，以pnisl、pped2為引物，擴(kuò)增出含有啟動(dòng)子、Nisin前導(dǎo)肽與pedA的融合基因片段N-pedA。
[0018](2)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建:
①在克隆的N-pedA基因兩端引入BWII酶切位點(diǎn)，經(jīng)純化后用限制性內(nèi)切酶BWII酶切；
②將載體質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶BWII酶切；
③步驟①和②的酶切產(chǎn)物用T4-DNA連接酶連接；
④酶連產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，在固體抗性培養(yǎng)基中培養(yǎng)；
⑤篩選陽性菌落，并提取質(zhì)粒；
⑥酶切質(zhì)粒，并進(jìn)行電泳鑒定目標(biāo)條帶大小正確。
[0019](3)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌Lactococcus lactis SZ325。
[0020](4)菌株培養(yǎng)后，采用NisiruPed1cin特定抗體進(jìn)行非競(jìng)爭(zhēng)性間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、N端氨基酸序列分析證實(shí)Nisin與Ped1cin的共表達(dá)。采用抑菌圈法，以Nisin與Ped1cin的特異指示菌溶壁微球菌和利斯特氏菌做抑菌實(shí)驗(yàn)，菌株培養(yǎng)液中活性Nisin與Ped1cin的產(chǎn)量均可達(dá)到原對(duì)照菌株95%以上。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種乳酸乳球菌，其特征在于:是從牛奶中分離得到的，其生產(chǎn)乳酸鏈球菌素Nisin,并且對(duì)乳酸片球菌素Ped1cin有天然抗性，命名為乳酸乳球菌SZ325，菌種保藏號(hào)為 CGMCC N0.10613。
2.一種利用權(quán)利要求1所述的乳酸乳球菌同時(shí)生產(chǎn)乳酸鏈球菌素和乳酸片球菌素的方法，其特征在于包括如下步驟: (I)構(gòu)建含有Nisin前導(dǎo)肽序列N與Ped1cin結(jié)構(gòu)基因pedA的雜合基因N-pedA: ①人工合成一對(duì)基因特異性擴(kuò)增引物:pnisl:50 -AACGGCTCTGATTAAATTCTGAAGTTT-30 ；pnis2:50 -CCATTACCGTAGTATTTGCGTGGTGATGCACCTGAATC-30 ； 此兩個(gè)引物含有與Nisin自身啟動(dòng)子、前導(dǎo)肽基因兩側(cè)的兩條鏈互補(bǔ)序列，引物pnis2的50端17個(gè)核苷酸序列與pedA序列互補(bǔ)；以菌株L3ctococcus lactis SZ325的DNA為模板，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR擴(kuò)增含有啟動(dòng)子與Nisin前導(dǎo)肽基因片段； ②再人工合成一對(duì)基因特異性擴(kuò)增引物:ppedl -M -GGTGCATCACCACGCAAATACTACGGTAATGGG-30 ；pped2 -M -TTATGATGCCAGCTCAGCATAAT-30 ； 此兩個(gè)引物含有與PedA基因兩側(cè)的兩條鏈互補(bǔ)序列，引物ppedl的50端15個(gè)核苷酸序列與Nisin前導(dǎo)肽序列互補(bǔ)；以含有ped1cin操縱子的DNA為模板，PCR擴(kuò)增pedA基因片段; ③將步驟①和②中獲得的兩擴(kuò)增片段等量混合作為二次PCR模板，以pnisl、pped2為引物，擴(kuò)增出含有啟動(dòng)子、Nisin前導(dǎo)肽與pedA的融合基因片段N-pedA ； (2)在克隆的N-pedA基因兩端引入酶切位點(diǎn)BWII，經(jīng)純化后用限制性內(nèi)切酶BWII酶切，酶切產(chǎn)物與經(jīng)過Bg7II酶切的載體質(zhì)粒連接，再轉(zhuǎn)化菌株Lactococcus IactisSZ325 ； (3)菌株培養(yǎng)后，即使得Nisin與Ped1cin的共表達(dá)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用一種乳酸乳球菌同時(shí)生產(chǎn)乳酸鏈球菌素和乳酸片球菌素的方法，其特征在于，步驟(3)菌株培養(yǎng)后，采用NisiruPed1cin特定抗體進(jìn)行非競(jìng)爭(zhēng)性間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、N端氨基酸序列分析證實(shí)Nisin與Ped1cin的共表達(dá)。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種乳酸乳球菌及利用其同時(shí)生產(chǎn)乳酸鏈球菌素Nisin和乳酸片球菌素Pediocin的方法。采用接頭重疊延伸技術(shù)，進(jìn)行二次PCR擴(kuò)增出含有Nisin前導(dǎo)肽序列與Pediocin結(jié)構(gòu)基因的雜合基因片段N-pedA，將N-pedA克隆到載體質(zhì)粒中，再轉(zhuǎn)化菌種保藏號(hào)為CGMCC No.10613的Nisin產(chǎn)生菌乳酸乳球菌Lactococcus lactis SZ325，該菌株即可以同時(shí)生產(chǎn)Nisin和Pediocin，測(cè)定結(jié)果表明兩種細(xì)菌素產(chǎn)量均達(dá)到原對(duì)照菌株95%以上。本發(fā)明為Nisin與Pediocin共表達(dá)提供了新方法，提高了菌株生產(chǎn)效率，而且Nisin與Pediocin互相補(bǔ)充，擴(kuò)大了抑菌譜。CGMCC No.1061320150311
【IPC分類】C12N1-21, C12R1-46, C12N15-74, C07K14-315
【公開號(hào)】CN104845925
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510265307
【發(fā)明人】宋建民, 張琴, 王德海, 宛榮生
【申請(qǐng)人】安徽民禎生物工程有限公司
【公開日】2015年8月19日
【申請(qǐng)日】2015年5月22日