造血干細(xì)胞來(lái)源樹突狀細(xì)胞的大批量制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及⑶34+造血干細(xì)胞的一種新用途，特別涉及到臍帶血來(lái)源的⑶34+造血 干細(xì)胞誘導(dǎo)大批量樹突狀細(xì)胞的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 樹突狀細(xì)胞（Dendritic cell，DC)是存在于人體的能夠誘發(fā)免疫反應(yīng)的專職抗原 提呈細(xì)胞。目前，基于DC細(xì)胞制備的特異性DC抗腫瘤疫苗已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床。DC細(xì)胞 主要來(lái)源于骨髓，臍帶血，或外周血單個(gè)核細(xì)胞。通過(guò)負(fù)載腫瘤抗原，DC能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生 強(qiáng)大的特異性抗腫瘤免疫，全球已啟動(dòng)超過(guò)150個(gè)臨床試驗(yàn)以驗(yàn)證DC疫苗對(duì)各種腫瘤的安 全性及有效性。
[0003]目前DC生物制備方法大多數(shù)都是采用腫瘤病人的自體外周血單個(gè)核細(xì)胞，但存 在數(shù)量少、抗原遞呈能力差等問(wèn)題。被譽(yù)為"造血干細(xì)胞池"的新鮮臍帶血中含有大量的 CD34+造血干細(xì)胞，比起外周血和骨髓中的干細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖潛能和分化潛能。近年來(lái) 已有某些方法從造血干細(xì)胞中培養(yǎng)出數(shù)量大、功能強(qiáng)的DC細(xì)胞，使DC細(xì)胞的大規(guī)模生產(chǎn)、 儲(chǔ)存和臨床應(yīng)用成為可能。
[0004]本方法旨在從產(chǎn)后廢棄物臍帶血獲取⑶34+造血干細(xì)胞并于體外誘導(dǎo)生成大量DC 前體細(xì)胞，通過(guò)功能性實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證CD34-DC前體細(xì)胞是誘導(dǎo)分化為未成熟DC的優(yōu)質(zhì)前體細(xì) 胞。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明主要目的是解決目前常用的外周血來(lái)源DC數(shù)量少、抗原吞噬能力差、抗原 提成功能低、個(gè)體差異大等實(shí)際問(wèn)題。本發(fā)明所闡述的大批量CD34-DC的制備方法、流程和 工藝，相較文獻(xiàn)中發(fā)表的臍帶血⑶34+造血干細(xì)胞來(lái)源DC的培養(yǎng)擴(kuò)增技術(shù)，具有制備工藝 先進(jìn)可靠、DC數(shù)量大、功能強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，是對(duì)現(xiàn)有制備方法的創(chuàng)新、改進(jìn)和升級(jí)。
[0006]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：提供一種臍血⑶34+造血干細(xì)胞誘導(dǎo)大量DC的制備 方法，包括以下步驟： (1)從健康足月產(chǎn)孕婦分娩后新鮮臍帶血中分離出單個(gè)核細(xì)胞。
[0007] (2)臍血⑶34+造血干細(xì)胞的獲得：從分離的臍血單個(gè)核細(xì)胞中，通過(guò)免疫磁珠分 選法（MACS)獲得⑶34+造血干細(xì)胞。
[0008] (3)臍血^34+造血干細(xì)胞的擴(kuò)增：使用61^5?/50?擴(kuò)增培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，每3天 更換新鮮的GM-CSF/SCF培養(yǎng)基，將擴(kuò)增的懸浮細(xì)胞按接種密度（1-2) X 105/ml依次轉(zhuǎn)移到 新的六孔板、25cm2或75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，連續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)30天。
[0009] (4)⑶34-DC前體細(xì)胞的收獲：上述培養(yǎng)的第8天起，相繼有DC前體細(xì)胞開始貼 壁，將懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)移到新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)，收獲貼壁細(xì)胞為臍血CD34-DC前 體細(xì)胞，其進(jìn)一步培養(yǎng)或置于液氮長(zhǎng)期凍存?zhèn)溆?；新鮮或凍存復(fù)蘇后的CD34-DC前體細(xì)胞 可繼續(xù)在GM-CSF/IL-4培養(yǎng)基中進(jìn)行未成熟DC的誘導(dǎo)擴(kuò)增。此后連續(xù)30天的培養(yǎng)過(guò)程中， 每3天收獲一批貼壁的⑶34-DC前體細(xì)胞。
[0010] 在所述（1)臍血單個(gè)核細(xì)胞分離的方法，包括以下步驟： 采集健康足月產(chǎn)孕婦分娩后新鮮臍帶血50ml，在3000r/min條件下離心10min，棄上層 血漿，加入無(wú)菌生理鹽水和羥乙基淀粉按1:1:1比例重懸沉淀的臍帶血細(xì)胞，放置37°C溫 箱中孵育30min使紅細(xì)胞沉淀，用小吸管吸出上層懸液，在避光的條件下，按2:1的比例加 入到人淋巴細(xì)胞分離液上，900g/min離心30min，小吸管吸出單個(gè)核細(xì)胞層，加入無(wú)菌生理 鹽水重懸細(xì)胞，1500r/min離心10min，反復(fù)洗2次，獲得單個(gè)核細(xì)胞。
[0011] 在所述（2)獲得⑶34+造血干細(xì)胞的步驟中，本發(fā)明采用免疫磁珠陽(yáng)性分選法獲 得CD34+造血干細(xì)胞。免疫磁珠陽(yáng)性分選法是基于細(xì)胞表面抗原能與連接在磁珠上的特異 性單克隆抗體相結(jié)合，在外磁場(chǎng)作用下，與磁珠相連的細(xì)胞被吸附而滯留在磁場(chǎng)中，無(wú)該種 表面標(biāo)記抗原的細(xì)胞不能與磁珠的抗體結(jié)合而沒(méi)有磁性，不停留在磁場(chǎng)中，從而使高純度 的⑶34+造血干細(xì)胞被分選出來(lái)，進(jìn)而可從這些⑶34+造血干細(xì)胞中誘導(dǎo)和擴(kuò)增出大批量的 CD34-DC前體細(xì)胞。
[0012] 在所述（3)⑶34+造血干細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)的方法中，本發(fā)明采用的GM-CSF/SCF培養(yǎng) 基，使用含有10%FBS、100ng/ml重組人GM-CSF、及50ng/ml SCF的頂DM細(xì)胞培養(yǎng)基。
[0013] 在所述（4)的方法中，用于臍血⑶34-DC前體細(xì)胞進(jìn)一步誘導(dǎo)分化為未成熟DC的 GM-CSF/IL-4 培養(yǎng)基，使用含 800units/ml GM/CSF 和 500units/ml IL-4 的 AM V 細(xì)胞培養(yǎng) 基。
[0014] 與現(xiàn)有的技術(shù)相比，本發(fā)明具有的積極有效效果： 臍帶血分離⑶34+造血干細(xì)胞誘導(dǎo)的DC相比文獻(xiàn)中發(fā)表的臍帶血⑶34 +造血干細(xì)胞來(lái) 源DC的培養(yǎng)擴(kuò)增技術(shù)，具有生成DC數(shù)量大的突出優(yōu)勢(shì)，約（2-7)*109/50ml臍帶血，且相比 傳統(tǒng)外周血單狀核細(xì)胞誘導(dǎo)的DC具有更強(qiáng)的抗原吞噬能力，更高的表面分子表達(dá)水平和 類似的刺激淋巴細(xì)胞增殖的能力。
【附圖說(shuō)明】
[0015] 圖1A和圖1B分別為DC形態(tài)特征圖。圖1A為⑶34-DC成熟后倒置顯微鏡下的形 態(tài)（400X);圖1B為PBMC-DC成熟后倒置顯微鏡下的形態(tài)（400X)。
[0016] 圖2為⑶34-DC在未成熟和成熟狀態(tài)下，其⑶80、⑶83、⑶86和HLA-DR的表達(dá)均 顯著高于PBMC-DC柱形圖。
[0017] 圖3為新鮮和凍存復(fù)蘇的CD34-DC前體細(xì)胞，其抗原吞噬能力均顯著優(yōu)于所對(duì)應(yīng) 狀態(tài)下PBMC-DC柱形圖。
[0018] 圖4為⑶34-DC和PBMC-DC -樣具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖能力折線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 實(shí)施例1臍帶血來(lái)源DC的制備 分離臍帶血單核細(xì)胞： 1. 無(wú)菌注射器采集健康足月產(chǎn)孕婦分娩后新鮮臍帶血50 ml，肝素抗凝； 2. 將50ml臍帶血平均分裝到2個(gè)50ml離心管內(nèi)，然后置于離心機(jī)中離心10 min，轉(zhuǎn) 速為3000 r / min ;離心后用吸管將上層血漿吸出后棄之； 3. 分別按1 :1 :1的比例，加無(wú)菌生理鹽水和羥乙基淀粉液到上一步的沉淀臍帶血中， 使細(xì)胞重懸；置于37°C培養(yǎng)箱中孵育30分鐘，使紅細(xì)胞沉淀； 4. 待紅細(xì)胞沉淀后，用小吸管吸出上層液體，在避光條件下按2 :1 (2份體積細(xì)胞混懸 液：1份體積淋巴分離液)的比例將細(xì)胞混懸液沿管壁緩慢加入人淋巴細(xì)胞分離液的液面之 上，小心置于離心機(jī)中，900g/min無(wú)制動(dòng)離心30min ; 5. 離心后取出分為四層液面的離心管，小吸管吸