一種臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法及其試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及內(nèi)皮祖細(xì)胞分離培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法及其試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]心腦血管疾病就是心臟血管和腦血管的疾病統(tǒng)稱，泛指由于高脂血癥、血液黏稠、動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓等所導(dǎo)致的心臟、大腦及全身組織發(fā)生缺血性或出血性疾病。是一種嚴(yán)重威脅人類，特別是50歲以上中老年人健康的常見病，即使應(yīng)用目前最先進(jìn)、完善的治療手段，仍可有50 %以上的腦血管意外幸存者生活不能完全自理，全世界每年死于心腦血管疾病的人數(shù)高達(dá)1500萬人，居各種死因首位。因此，急需一種能夠有效防治心腦血管疾病的治療策略。
[0003]臍帶血是嬰兒出生后，留在胎盤和臍帶中的血液，含有豐富的干細(xì)胞。其主要含造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)。除此以外，臍血中的單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)過誘導(dǎo)培養(yǎng)，還可以得到內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)。內(nèi)皮祖細(xì)胞是一種能直接分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，不僅參與人胚胎血管生成，而且最近幾年研宄發(fā)現(xiàn)EPCs也參與出生后的血管新生過程，提示EPCs在缺血性疾病、創(chuàng)傷愈合中的重要治療作用和廣闊的臨床運(yùn)用前景。
[0004]近年來研宄發(fā)現(xiàn)，EPCs在心血管疾病、肢體缺血性疾病的治療中發(fā)揮重要作用，因此，體外EPCs可作為血管新生的“替代策略”廣泛應(yīng)用于臨床。此外EPCs容易獲取、操作簡(jiǎn)單、定向移植(歸巢)于血管生成部位，所分化生成的內(nèi)皮細(xì)胞是最接近于血流的一層細(xì)胞，釋放出的活性物質(zhì)容易通過血流擴(kuò)散到全身，從而發(fā)揮廣泛的作用，因此EPCs還是基因治療理想的靶細(xì)胞。EPCs可來源于臍血、骨髓、外周血，Schmidt D等報(bào)道臍血來源的EPCs具有體外增殖活性，這些細(xì)胞持續(xù)表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞表型。提示臍血來源的EPCs可以作為組織工程理想的自體細(xì)胞來源。
[0005]然而，每份臍血所含內(nèi)皮祖細(xì)胞有限，為了滿足治療性移植要求，需進(jìn)一步體外擴(kuò)增EPCs。現(xiàn)有的血液中內(nèi)皮祖細(xì)胞分離培養(yǎng)方法一般采用將培養(yǎng)皿包被，之后從血液中分離出單個(gè)核細(xì)胞后貼壁培養(yǎng)，該方法效率低，僅能從血液分離到少量的內(nèi)皮祖細(xì)胞，之后的擴(kuò)增效率亦較低，細(xì)胞增殖較慢。因此，提供一種收獲量大且增殖迅速的臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]有鑒于此，本發(fā)明提供了一種臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法及其試劑盒。本發(fā)明提供的方法培養(yǎng)的臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞比傳統(tǒng)方法得到的細(xì)胞，形態(tài)方面更為均一，細(xì)胞匯合度更高，細(xì)胞收獲量更大，細(xì)胞增殖更為迅速，細(xì)胞表面抗原表達(dá)率更高。
[0007]為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案:
[0008]本發(fā)明提供了一種臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，包括如下步驟:
[0009]將臍血單個(gè)核細(xì)胞預(yù)先貼壁培養(yǎng)，取未貼壁的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基為含有胎球蛋白的完全培養(yǎng)基。
[0010]本發(fā)明將臍血單個(gè)核細(xì)胞預(yù)先貼壁培養(yǎng)后，再取未貼壁的細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)EPCs，分離培養(yǎng)的培養(yǎng)基中添加胎球蛋白，促進(jìn)EPCs的貼壁、增殖。本發(fā)明提供的方法培養(yǎng)的臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞比傳統(tǒng)方法得到的細(xì)胞，形態(tài)方面更為均一，細(xì)胞匯合度更高，細(xì)胞收獲量更大，細(xì)胞增殖更為迅速，細(xì)胞表面抗原表達(dá)率更高。
[0011]作為優(yōu)選，胎球蛋白的濃度為0.5?5mg/mL。
[0012]優(yōu)選地，胎球蛋白的濃度為lmg/mL。
[0013]在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，胎球蛋白為胎球蛋白B。
[0014]作為優(yōu)選，細(xì)胞培養(yǎng)的時(shí)間為5?10天。
[0015]優(yōu)選地，細(xì)胞培養(yǎng)的時(shí)間為8天。
[0016]作為優(yōu)選，預(yù)先貼壁培養(yǎng)的時(shí)間為12?36h。
[0017]優(yōu)選地，預(yù)先貼壁培養(yǎng)的時(shí)間為24h。
[0018]在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，預(yù)先貼壁培養(yǎng)的培養(yǎng)基為含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基。
[0019]在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，預(yù)先貼壁培養(yǎng)的培養(yǎng)基中還含有生長(zhǎng)因子，生長(zhǎng)因子為VEGF、FGF、IGF或EGF中的一種或幾種。
[0020]在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，預(yù)先貼壁培養(yǎng)的培養(yǎng)基中含有20ng/mL VEGF,20ng/mL FGFUng/mL IGFUOng/mL EGF。
[0021]在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，預(yù)先貼壁培養(yǎng)的培養(yǎng)皿為明膠包被的培養(yǎng)皿。
[0022]作為優(yōu)選，預(yù)先貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞密度為107/mL。
[0023]在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，預(yù)先貼壁培養(yǎng)是在37°C、5% CO2、飽和濕度條件下進(jìn)行。
[0024]在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，在細(xì)胞培養(yǎng)之后還包括采用消化酶消化內(nèi)皮細(xì)胞集落、傳代培養(yǎng)的步驟。
[0025]在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，消化酶為胰酶。
[0026]在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，臍血單個(gè)核細(xì)胞的制備方法為:取臍血與PBS混合，離心，棄上清及脂肪層，細(xì)胞沉淀用PBS重懸，加入淋巴細(xì)胞分離液，離心，獲得臍血單個(gè)核細(xì)胞。
[0027]本發(fā)明還提供了一種分離培養(yǎng)臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞的試劑盒，包括胎球蛋白、含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基。
[0028]在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，胎球蛋白為胎球蛋白B。
[0029]在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，試劑盒還含有生長(zhǎng)因子，生長(zhǎng)因子為VEGF、FGF、IGF或EGF中的一種或幾種。
[0030]在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，試劑盒還含有消化酶。
[0031 ] 在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，消化酶為胰酶。
[0032]在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，試劑盒還含有淋巴細(xì)胞分離液。
[0033]本發(fā)明提供了一種臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法及其試劑盒。該方法包括:將臍血單個(gè)核細(xì)胞預(yù)先貼壁培養(yǎng)，取未貼壁的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基為含有胎球蛋白的完全培養(yǎng)基。本發(fā)明提供的方法培養(yǎng)的臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞比傳統(tǒng)方法得到的細(xì)胞，形態(tài)方面更為均一，細(xì)胞匯合度更高，細(xì)胞收獲量更大，細(xì)胞增殖更為迅速，細(xì)胞表面抗原表達(dá)率更高。
【附圖說明】
[0034]圖1示PO代細(xì)胞形態(tài)；其中，Al圖示本發(fā)明實(shí)施例1方法培養(yǎng)2天的EPCs，A2圖示本發(fā)明實(shí)施例1方法培養(yǎng)9天的EPCs，A3圖示本發(fā)明實(shí)施例1方法培養(yǎng)13天的EPCs ；BI圖示傳統(tǒng)方法培養(yǎng)2天的EPCs，B2圖示傳統(tǒng)方法培養(yǎng)9天的EPCs，B3圖示傳統(tǒng)方法培養(yǎng)13天的EPCs ；
[0035]圖2示細(xì)胞的增殖曲線；
[0036]圖3示細(xì)胞表面抗原Vwf_cy2的表達(dá)率；其中圖A示傳統(tǒng)方法分離培養(yǎng)EPCs的表面抗原Vwf-cy2表達(dá)率；圖B示本發(fā)明實(shí)施例1方法分離培養(yǎng)細(xì)胞的表達(dá)率。
【具體實(shí)施方式】
[0037]本發(fā)明公開了一種臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法及其試劑盒，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0038]本發(fā)明提供的臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法及其試劑盒中所用試劑或儀器均可由市場(chǎng)購(gòu)得。
[0039]下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明:
[0040]實(shí)施例1臍血EPCs的分離與培養(yǎng)
[0041]臍血取自足月健康新生兒的臍帶，加入復(fù)方枸櫞酸鈉(CPD-A)抗凝，采集后在24h內(nèi)進(jìn)行分離